Vi præsenterer en opsætningsopsætning og protokol, der muliggør automatisk analyse af nematoden, Caenorhabditis elegans 'præference for opløselige forbindelser i en populationbaseret analyse. Denne artikel beskriver opførelsen af et adfærdskammer, den adfærdsmæssige analyseprotokol og brugen af videoanalyseprogrammer.
Den nematode, Caenorhabditis elegans 'kompakte nervesystem af kun 302 neuroner ligger under et varieret repertoire af adfærd. For at lette dissektionen af de neurale kredsløb, der ligger til grund for disse adfærd, er udviklingen af robuste og reproducerbare adfærdsmæssige analyser nødvendig. Tidligere C. elegans adfærdsmæssige undersøgelser har anvendt variationer af en "drop test", et "chemotaxis assay" og et "retention assay" for at undersøge C. elegans reaktion på opløselige forbindelser. Fremgangsmåden beskrevet i denne artikel søger at kombinere de komplementære styrker af de tre ovennævnte analyser. Kort fortalt er en lille cirkel midt på hver analyseplade opdelt i fire kvadranter med kontrol og eksperimentelle løsninger skiftevis placeret. Efter tilsætningen af ormene er assaypladerne indlæst i et adfærdskammer, hvor mikroskopkameraer registrerer ormernes møder med de behandlede områder. Automatiseret videoanalyse udføres derefter aNd en præferenceindeks (PI) værdi for hver video genereres. Videooptagelses- og automatiserede analysegenskaber ved denne metode minimerer eksperimentets involvering og eventuelle tilknyttede fejl. Endvidere anvendes små mængder af forsøgsforbindelsen pr. Assay, og adfærdskammerets multikameraopsætning øger eksperimentelt gennemløb. Denne metode er særlig nyttig til at udføre adfærdsmæssige skærmbilleder af genetiske mutanter og nye kemiske forbindelser. Denne metode er imidlertid ikke hensigtsmæssig til undersøgelse af stimulusgradientnavigering på grund af nærhed af kontrol- og eksperimentelle opløsningsområder. Det bør heller ikke bruges, når kun en lille population af orme er til rådighed. Selvom det kun er egnet til at analysere responser kun på opløselige forbindelser i sin nuværende form, kan denne metode let ændres til at rumme multimodal sensorisk interaktion og optogenetiske undersøgelser. Denne metode kan også tilpasses til at analysere de kemosensoriske responser af andre nematod-arter. </p>
Foraging dyr skal integrere input fra flere sensoriske modaliteter og vælge passende adfærdsmæssige strategier for at kunne navigere deres miljø. Forståelse af hvordan eksterne sensoriske indgange modtages og transduceres til neurale informationer til at styre actionvalg er et centralt mål inden for neurobiologi. Den genetisk trækkelige nematode, C. elegans , er en attraktiv modelorganisme, hvor man studerer de neurale mekanismer, der ligger til grund for sensorisk biologi og multimodal integration. Selvom C. elegans kun har 302 neuroner, kan den opdage og diskriminere mellem en lang række miljømæssige stimuli, herunder opløselige forbindelser, flygtige lugtstoffer og omgivelsestemperatur 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 . DetNematode C. elegans er stærkt afhængig af dets kemosensoriske apparat for at lokalisere fødekilder og til at advare sig mod potentielle trusler. Således spiller adfærdsmæssige analyser, der er designet til at screene svarene fra vildtype og mutant C. elegans til kemiske stimuli, en afgørende rolle i dissekere de genetiske, cellulære og neurale mekanismer, der ligger til grund for C. elegans bemærkelsesværdige sensoriske evner.
For at analysere responset på opløselige forbindelser er der beskrevet tre typer af assays – drop testen, chemotaxis assayet og retention assayet. I drop-testen placeres en lille dråbe af forbindelsen i en bevægelsesorms hale, og ormens beslutning om at vende om eller bevæge sig fremad, når væsken når det fremre sensoriske apparat, er scoret 4 . Drop testen kræver lidt eksperimentelt forberedelse og er nyttigt, når ormestørrelsen er lille, som i tilfældet med laserdrevne orme. Men som kun en ormKan analyseres ad gangen, og eksperimentatoren skal være til stede i løbet af analysens varighed, kan dråptesten være tidskrævende. Drop testen er også sårbar over for variationer i drop levering mellem hver orm i en prøve, hvilket kan påvirke de samlede resultater af analysen. En anden begrænsning af drop testen er, at den kun kan bruges til at analysere ormens reaktion på aversive forbindelser, da det ikke er muligt at diskriminere mellem en attraktiv eller neutral virkning af forbindelsen fra ormens fremadrettede bevægelse.
Chemotaxis-analysen for opløselige forbindelser indebærer generelt at dele en agarplade i fire kvadranter, idet den eksperimentelle opløsning blandes i agaret af to modstående kvadranter, og kontrolopløsningen blandes i de andre to kvadranter 8 , 9 . Ved analysens begyndelse placeres en dråbe buffer indeholdende orme i midten af pladen og antallet af orme i Hver kvadrant bliver scoret på forskellige tidspunkter. Chemotaxis-analysen giver større statistisk effekt sammenlignet med drop testen, da et stort antal orme testes i hvert assay. En begrænsning af denne metode er imidlertid, at fremstilling af chemotaxis-assaypladerne kræver store mængder af forsøgsforbindelsen. Dette vil gøre det vanskeligt at udføre storskala adfærdskanaler, hvis en kompliceret rensningsproces med begrænsede udbytter er påkrævet for at opnå den ønskede forbindelse, som i tilfældet med ascarosid-signalmolekylerne 10 . Derudover er manuel tælling af orme gennem analysen modtagelig for fejl, og pladens forstyrrelse under tællingsprocessen kan påvirke resultaterne.
I modsætning til de to ovennævnte fremgangsmåder udnytter retensionsassayet maskinsyn, som minimerer fejl under scoreprocessen og reducerer eksperimentatorens interferens under analysen > 11. Computeriseret analyse af videooptagelser af ormadfærd kan også potentielt afsløre subtile adfærdsmønstre, som vil blive savnet, når scoring kun udføres på et par diskrete tidspunkter. I retentionsassayet tilsættes to opløsningspletter på modsatte sider af en lille cirkulær bakteriel fødeplaster efterfulgt af placeringen af et lille antal orme i midten af fødeplaster. Ormenes adfærd registreres derefter, analyseres, og en præferenceindeksværdi beregnes ud fra det samlede antal ormpixel i hver opløsningsregion. Skønt tilstedeværelsen af et attraktivt fødepatch gør det muligt at anvende mindre populationer af orme i hvert assay, har fødevarer tidligere vist sig at sensibilisere undvikelsesadfærd til opløselige repellanter 12 . Desuden udviser orme et fotofob svar på kortbølgelængde lys, og brugen af mikroskop lyskilder, der udsender hvidt lys i opførelsen af optagelsesoptagelsen, kan påvirke adfærdS = "xref"> 13.
Formålet med metoden, der er diskuteret i denne artikel, er at registrere og analysere C. elegans ' præference for opløselige forbindelser under anvendelse af en populationsbaseret analyse. Til dette formål integrerer og forbedrer den nuværende metode aspekter fra alle tre af de tidligere diskuterede metoder. Det gør det muligt at teste store populationer af orme og kræver kun små mængder af den eksperimentelle opløsning, som skal anvendes i hvert assay. Desuden udføres analysen inden for et specialbygget lukket adfærdskammer med infrarød LED-baggrundsbelysning for at minimere virkningerne af kortbølgelængde lys på adfærd. Hvert kammer kan også udstyres med flere mikroskopkameraer, hvilket øger eksperimentelt gennemløb uden at gå på kompromis med bænkplads. Endelig udsender videoanalyseprogrammet præferenceindeksværdien for hver video samt et ledsagende ormbelægningsplan for at visualisere befolkningsadfærdsdynamikken over tid. Kammeropsætningen og aSsay-protokollen kan modificeres yderligere for at studere multimodale adfærdsmæssige reaktioner, såsom virkningen af lugtstoffer eller temperatur på kemosensoriske adfærd.
Denne artikel beskriver opførelsen af adfærdskammeret og analyseprotokollen. Det demonstrerer også anvendeligheden af denne fremgangsmåde ved at analysere responsen af vildtype-orme og kemosensoriske defekte mutanter til det kendte opløselige afstødningsmiddel, kobberioner 4 . Endelig er videoanalyseprocessen ved hjælp af den medfølgende software detaljeret.
Et kritisk trin i protokollen sikrer, at assaypladerne har en ensartet tørhedsgrad over forskellige eksperimentelle dage. Forskellige tørhedsniveauer vil resultere i forskellige diffusionshastigheder af opløsningen i agar og følgelig variationer i adfærdsmæssigt udfald. Analyseplader skal således altid laves frisk om eftermiddagen før forsøg. Antallet af orme testet pr. Test bør også reguleres for at lette sammenligningen mellem behandlinger. Til reference ligger en vildtypeorm 4-10 æg / h i gennemsnit, der giver> 360 orme pr. Assay, hvis ormsynkroniseringsprotokollen ovenfor følges 17 . Hvis visse mutante stammer er æglægning defekte, skal du vælge flere gravide voksne orme til æglægning for at nå målantalet afkom. Et andet vigtigt skridt i protokollen er at håndtere orme forsigtigt under vaskeprocessen og ormen placering. Orme er følsomme over for mekaniske stimuli, som fremkalder stressresponser sådan S reverseringer og æglægningshæmning 18 . Derudover bør man være opmærksom på at definere ROI nøjagtigt og for at bestemme den optimale tærskelkonstantværdi for specifikke lysforhold, før man fortsætter med videoanalysen. Det anbefales også at kalibrering og tærskelprocesserne gentages, hvis der er gået en længere periode siden det sidste forsøg blev kørt.
En begrænsning af denne metode er, at den ikke er egnet til at analysere små ormpopulationer. Men hvis de relevante kontroller til bestemmelse af indflydelsen af tilstedeværelsen af mad på den sensoriske adfærd udføres, er det også muligt at anvende mad til at begrænse ormernes rumlige udforskningssted som i retensionsassayet med denne opsætning. Desuden er denne metode ikke beregnet til at studere stimulusgradientnavigation på grund af nærheden og små mængder af de anvendte kontrol- og forsøgsløsninger.
E_content "> I fremtiden kan programmeringssoftware, der muliggør udnyttelse af multi-orm og single-worm-ekstraktion, integreres i dette system 19 , 20. Optagelse af subtile adfærdsparametre for enkeltorms adfærd som omdrejningshastigheder og amplitude af kropsbøjninger vil tilvejebringe Et mere detaljeret billede af en individuel orms kemosensoriske opførsel i sammenhæng med et populationbaseret assay. Analysen kan også modificeres for at studere habituation ved at køre huller gennem afkastet ved hjælp af sprøjtenåle med passende måleformat og fylde hullerne med agar infunderet Med forsøgsforbindelsen eller kontrolpufferen. Dette vil sikre en mere konsistent overfladekoncentration af forbindelsen over en længere periode af optagetid, som det er nødvendigt under forsøgsforsøg. En anden potentiel anvendelse af denne metode er at gennemføre sammenlignende adfærdsstudier på tværs af forskellige nematodarter. Hertil kommer adfærdskammeretKan modificeres på flere måder til at studere adfærdsmæssige reaktioner på multimodale stimuli. Til optogenetiske applikationer kan højintensitets LED-arrays fastgøres ved siden af kameraholderen for selektivt at aktivere neuroner af interesse under analysen. Varmeelementer, kølesystemer og temperatursensorer kan også tilføjes til opsætningen for at studere temperaturens virkninger på sensoriske opførsel. Desuden kan lugtleveringssystemer installeres inde i kammeret for at undersøge interaktioner mellem lugt- og kemosensoriske modaliteter.The authors have nothing to disclose.
Nogle stammer blev leveret af Caenorhabditis Genetics Center (CGC), som finansieres af NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Dette arbejde støttes af Howard Hughes Medical Institute, hvor PWS er en efterforsker.
Aluminum T-slotted framing extrusions | McMaster-Carr | 47065T101 | Single profile, 1" size, solid |
Brackets | McMaster-Carr | 47065T236 | 1" long for 1" high single profile extrusions |
Compact end-feed fasteners | McMaster-Carr | 47065T139 | 1" (single), pack of 4 |
Twist-in solid panel holders | McMaster-Carr | 47065T251 | For 1" high extrusion |
Plastic end caps | McMaster-Carr | 47065T91 | For 1" high extrusion |
Optically clear cast acrylic sheet | McMaster-Carr | 8560K211 | 3/16" thick, 12" x 12" |
Vinyl-coated polyester fabric | McMaster-Carr | 88505K57 | 0.027" thick, 61" width, black |
Brass grommets | McMaster-Carr | 9604K22 | Trade size 0, 0.545" outer diameter |
Steel washers | McMaster-Carr | 90107A029 | 1/4" screw size |
Rounded head screws | McMaster-Carr | 90272A546 | 1/4"-20 thread size, 1-1/2" long |
Standard operating backlight | Smart Vision Lights | See local vendor | 8"x8", infrared 850nm |
IVP-C1 Variable Control Pot | Smart Vision Lights | See local vendor | |
T1 Power Supply | Smart Vision Lights | See local vendor | |
Dino lite Pro AM4113T | Dino-Lite Digital Microscope | See local vendor | |
MS09B microscope stand | Dino-Lite Digital Microscope | See local vendor |