Запись синаптической пластичности в острой гиппокампа ломтики в малообъемной рециркуляции-, перфузии и погружения типа камерная система
Summary
Этот протокол описывает стабилизации уровня кислорода в небольшой объем переработанной буфера и методологические аспекты записи активности зависимых синаптической пластичности погруженной острый гиппокампа ломтиками.
Abstract
Даже несмотря на то, что эксперименты на срезах головного мозга были в эксплуатации с 1951 года, сохраняются проблемы, которые снижают вероятность достижения стабильного и успешного анализа синаптической передачи модуляции при выполнении поле потенциальных или внутриклеточных записи. Эта рукопись описывает методологические аспекты, которые могут быть полезны в улучшении экспериментальных условий для поддержания острого мозга ломтиками и записи полевых возбуждающих постсинаптических потенциалов в камере коммерчески доступных погружения с блоком отток carbogenation. Отток carbogenation помогает стабилизировать уровень кислорода в экспериментах, которые полагаются на рециркуляции небольшой буфер водохранилища для повышения эффективности затрат наркотиков экспериментов. Кроме того рукопись представляет представитель эксперименты, которые изучить последствия различных carbogenation режимы и стимуляции парадигмы на деятельность зависимых синаптической пластичности синаптической передачи.
Introduction
В 1951 году сообщил первый острый мозга срез эксперименты были проведены1. В 1971 году, после успеха в vitro записей от piriform коры2,3 и обнаружения, что Нейроны гиппокампа поперечно взаимосвязаны вдоль оси septotemporal гиппокампа4, один из Первые записи в vitro гиппокампа нейронной активности было достигнуто5. Схожесть нейрофизиологических или neurostructural параметров нейронов в vivo и in vitro условиях по-прежнему являются предметом некоторых прений6, но в 1975 году, Schwartzkroin7 указал, что базальная свойства нейронов поддерживаются в пробирке и что ВЧ-стимуляция (например, тетанизацией) афферентов гиппокампа формирования вызывает длительное облегчение синаптический потенциал8. Электрофизиологические запись активности нейронов в vitro значительно расширил изучение клеточных механизмов деятельности зависимых синаптической пластичности9,10, которая была обнаружена в 1973 году Блисс и др. 11 в в естественных условиях экспериментов с кроликов.
Исследование активности нейронов или сигнальные пути в срезах головного мозга и особенно в острой срезах гиппокампа, теперь является стандартным инструментом. Однако удивительно, в пробирке эксперименты еще быть стандартизированы, что подтверждается несколько подходов, которые все еще существуют для подготовки и ведения острой гиппокампа ломтиками. Рид и др. (1988) 12 обзор методологических проблем для поддержания острого мозга ломтики в различных видов камер срез и выбор купать уровень средний, рН, температуры и кислорода. Эти параметры являются по-прежнему трудно контролировать в зале записи благодаря заказные элементы в vitro фрагментов записи установок. Публикации можно найти, что может помочь преодолеть некоторые из методологических проблем и что описывают новые типы погружения срез камер, например системы интерстициальных 3D microperfusion13, камере с расширенной ламинарного потока и кислорода 14, система с компьютеризированной температуры управления15, поставок и многокамерные записи системы16. Поскольку эти камеры не легко строить, большинство ученых полагаться на срез коммерчески доступных камер. Эти камеры может быть установлен на систему микроскопа, таким образом позволяя для комбинации электрофизиологии и флуоресценции изображений17,18,19. Поскольку эти камеры сохранить срезы мозга, погруженной в искусственных спинномозговой жидкости (ФАГО), высокий расход потока буфера решения необходимо поддерживать, увеличение за счет применения наркотиков. С этой целью мы включили системы рециркуляции перфузии с отток carbogenation, который обеспечивает достаточную стабильность для длительной записи потенциалов поля в камере фрагментов погружения с помощью относительно небольшого фаго тома. Кроме того мы кратко, как использование этой экспериментальной carbogenation/перфузии системы влияет на результат деятельности зависимых синаптической пластичности10 и как модулирует синаптическую ингибитированием киназы эукариотических удлинение фактор-2 (eEF2K) передачи20.
Protocol
Representative Results
Discussion
Хотя интерфейс ломтик камеры более надежные синаптических ответы25,26,27,28, погружения камеры обеспечивают дополнительное удобство для записи патч зажим и флуоресценции обработки изображений. Таким образом мы описали…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
W.W. провела, проанализированы и разработали экспериментов и написал рукопись. D.X. и К.П. помощь в подготовке рисунок и экспериментов. Эта работа была поддержана NSFC (31320103906) и 111 проекта (B16013) т.б.
Materials
| Reagents required | |||
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10019318 | |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10016318 | |
| KH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10017618 | |
| MgCl2·6H2O | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10012818 | |
| CaCl2 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10005861 | |
| NaHCO3 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10018960 | |
| Glucose | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10010518 | |
| NaH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 20040718 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | A4043 | |
| MgSO4 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 20025118 | |
| NaOH | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10019718 | |
| Tools and materials for dissection | |||
| Decapitators | Harvard apparatus | 55-0012 | for rat decapitation |
| Bandage Scissors | SCHREIBER | 12-4227 | for mouse decapitation |
| double-edge blade | Flying Eagle, China | 74-C | |
| IRIS Scissors | RWD, China | S12003-09 | |
| Bone Rongeurs | RWD, China | S22002-14 | |
| Spoon | Hammacher | HSN 152-13 | |
| dental cement spatula | Hammacher | HSN 016-15 | |
| dental double end excavator | Blacksmith Surgical, USA | BS-415-017 | |
| Vibrating Microtome | Leica, Germany | VT1200S | |
| surgical blade | RWD, China | S31023-02 | |
| surgical holder | RWD, China | S32007-14 | |
| Electrophysiology equipment and materials | |||
| Vertical Pipette Puller | Narishige, Japan | PC-10 | |
| Vibration isolation table | Meirits, Japan | ADZ-A0806 | |
| submerged type recording chamber | Warner Instruments | RC-26GLP | |
| thermostatic water bath | Zhongcheng Yiqi，China | HH-1 | |
| 4 Axis Micromanipulator | Sutter, USA | MP-285, MP-225 | |
| Platinum Wire | World Precision Instruments | PTP406 | |
| Amplifier | Molecular Devices, USA | Multiclamp 700B | |
| Data Acquisition System | Molecular Devices, USA | Digidata 1440A | |
| Anaysis software | Molecular Devices, USA | Clampex 10.2 | |
| Fluorescence Microscope | Nikon, Japan | FN1 | |
| LED light source | Lumen Dynamics Group, Canada | X-cite 120LED | |
| micropipettes | Harvard apparatus | GC150TF | extracelluar recording |
| borosilicate micropipettes | Sutter, USA | BF150-86 | patch clamp |
| tungsten electrode | A-M Systems, USA | 575500 | |
| peristaltic pump | Longer, China | BT00-300T | |
| tubes for peristaltic pump | ISMATEC, Wertheim, Germany | SC0309 | 1x inflow, ID: 1.02mm |
| tubes for peristaltic pump | ISMATEC, Wertheim, Germany | SC0319 | 2x tubes for outflow, ID: 2.79 mm |
| CCD camera | PCO, Germany | pco.edge sCMOS | |
| lens cleaning paper | Kodak | ||
| 50 ml conical centrifuge tube | Thermo scientific | 339652 | |
| Prechamber | Warner Instruments | BSC-PC | |
| Inline heater | Warner Instruments | SF-28 | |
| Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324B |
Referencias
- McIlwain, H. Metabolic response in vitro to electrical stimulation of sections of mammalian brain. Biochem J. 48 (4), (1951).
- McIlwain, H., Richards, C. D., Somerville, A. R. Responses in vitro from the piriform cortex of the rat, and their susceptibility to centrally-acting drugs. J Neurochem. 14 (9), 937-938 (1967).
- Yamamoto, C., McIlwain, H. Electrical activities in thin sections from the mammalian brain maintained in chemically-defined media in vitro. J Neurochem. 13 (12), 1333-1343 (1966).
- Andersen, P., Bliss, T. V., Lomo, T., Olsen, L. I., Skrede, K. K. Lamellar organization of hippocampal excitatory pathways. Acta Physiol Scand. 76 (1), 4-5 (1969).
- Skrede, K. K., Westgaard, R. H. The transverse hippocampal slice: a well-defined cortical structure maintained in vitro. Brain Res. 35 (2), 589-593 (1971).
- Kirov, S. A., Sorra, K. E., Harris, K. M. Slices have more synapses than perfusion-fixed hippocampus from both young and mature rats. J Neurosci. 19 (8), 2876-2886 (1999).
- Schwartzkroin, P. A. Characteristics of CA1 neurons recorded intracellularly in the hippocampal in vitro slice preparation. Brain Res. 85 (3), 423-436 (1975).
- Schwartzkroin, P. A., Wester, K. Long-lasting facilitation of a synaptic potential following tetanization in the in vitro hippocampal slice. Brain Res. 89 (1), 107-119 (1975).
- Reymann, K. G., Frey, J. U. The late maintenance of hippocampal LTP: requirements, phases, ‘synaptic tagging’, ‘late-associativity’ and implications. Neuropharm. 52 (1), 24-40 (2007).
- Bliss, T. V., Collingridge, G. L., Morris, R. G. Synaptic plasticity in health and disease: introduction and overview. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 369 (1633), 20130129 (2014).
- Bliss, T. V., Gardner-Medwin, A. R. Long-lasting potentiation of synaptic transmission in the dentate area of the unanaestetized rabbit following stimulation of the perforant path. J Physiol. 232 (2), 357-374 (1973).
- Reid, K. H., Edmonds, H. L., Schurr, A., Tseng, M. T., West, C. A. Pitfalls in the Use of Brain-Slices. Prog Neurobiol. 31 (1), 1-18 (1988).
- Rambani, K., Vukasinovic, J., Glezer, A., Potter, S. M. Culturing thick brain slices: an interstitial 3D microperfusion system for enhanced viability. J Neurosci Methods. 180 (2), 243-254 (2009).
- Hajos, N., et al. Maintaining network activity in submerged hippocampal slices: importance of oxygen supply. Eur J Neurosci. 29 (2), 319-327 (2009).
- Redondo, R. L., et al. Synaptic tagging and capture: differential role of distinct calcium/calmodulin kinases in protein synthesis-dependent long-term potentiation. J Neurosci. 30 (14), 4981-4989 (2010).
- Stopps, M., et al. Design and application of a novel brain slice system that permits independent electrophysiological recordings from multiple slices. J Neurosci Methods. 132 (2), 137-148 (2004).
- Behnisch, T., Matsushita, S., Knopfel, T. Imaging of gene expression during long-term potentiation. Neuroreport. 15 (13), 2039-2043 (2004).
- Karpova, A., et al. Encoding and transducing the synaptic or extrasynaptic origin of NMDA receptor signals to the nucleus. Cell. 152 (5), 1119-1133 (2013).
- Karpova, A., Mikhaylova, M., Thomas, U., Knopfel, T., Behnisch, T. Involvement of protein synthesis and degradation in long-term potentiation of Schaffer collateral CA1 synapses. J Neurosci. 26 (18), 4949-4955 (2006).
- Weng, W., Chen, Y., Wang, M., Zhuang, Y., Behnisch, T. Potentiation of Schaffer-Collateral CA1 Synaptic Transmission by eEF2K and p38 MAPK Mediated Mechanisms. Front Cell Neurosci. 10 (247), (2016).
- Meduna, L. J., Jackman, A. I. Carbon dioxide inhalation therapy. Res Publ Assoc Res Nerv Ment Dis. 31, 280-286 (1953).
- Edwards, F. A., Konnerth, A., Sakmann, B., Takahashi, T. A thin slice preparation for patch clamp recordings from neurones of the mammalian central nervous system. Pflugers Arch. 414 (5), 600-612 (1989).
- Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology. J Vis Exp. (49), (2011).
- Yuanxiang, P., Bera, S., Karpova, A., Kreutz, M. R., Mikhaylova, M. Isolation of CA1 nuclear enriched fractions from hippocampal slices to study activity-dependent nuclear import of synapto-nuclear messenger proteins. J Vis Exp. (90), e51310 (2014).
- Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. LTP in cultured hippocampal-entorhinal cortex slices from young adult (P25-30) rats. J Neurosci Meth. 130 (1), 19-32 (2003).
- Kloosterman, F., Peloquin, P., Leung, L. S. Apical and basal orthodromic population spikes in hippocampal CA1 in vivo show different origins and patterns of propagation. J Neurophysiol. 86 (5), 2435-2444 (2001).
- Thiemann, W., Malisch, R., Reymann, K. G. A new microcirculation chamber for inexpensive long-term investigations of nervous tissue in vitro. Brain Res Bull. 17 (1), 1-4 (1986).
- Shetty, M. S., et al. Investigation of Synaptic Tagging/Capture and Cross-capture using Acute Hippocampal Slices from Rodents. J Vis Exp. (103), (2015).
- Du, H., Lin, J., Zuercher, C. Higher efficiency of CO2 injection into seawater by a venturi than a conventional diffuser system. Bioresour Technol. 107, 131-134 (2012).
- Weinman, J., Mahler, J. An Analysis of Electrical Properties of Metal Electrodes. Med Electron Biol Eng. 2, 299-310 (1964).
- Fanselow, M. S., Dong, H. W. Are the dorsal and ventral hippocampus functionally distinct structures. Neuron. 65 (1), 7-19 (2010).
- Wang, M., et al. Translation of BDNF-gene transcripts with short 3′ UTR in hippocampal CA1 neurons improves memory formation and enhances synaptic plasticity-relevant signaling pathways. Neurobiol Learn Mem. , (2016).
