Synaptische plasticiteit opnemen in Acute Hippocampal plakjes onderhouden in een kleine volumes Recycling-, perfusie-, en onderdompeling-type kamer systeem
Summary
Dit protocol beschrijft de stabilisatie van het zuurstofgehalte in een klein volume van gerecycled buffer en methodologische aspecten van de opname van de activiteit-afhankelijke synaptische plasticiteit in verzonken acute hippocampal plakjes.
Abstract
Hoewel experimenten op segmenten van de hersenen zijn al in gebruik sinds 1951, problemen die de kans op het bereiken van een stabiele en succesvolle analyse van synaptische transmissie modulatie verminderen bij het uitvoeren van potentiële of intracellulaire veldopnames. Dit manuscript beschrijft de methodologische aspecten die nuttig wellicht bij het verbeteren van de experimentele omstandigheden voor het onderhoud van acute hersenen segmenten en voor het vastleggen van veld excitatory postsynaptisch potentieel in een kamer verkrijgbare onderdompeling met een uitstroom-carbogenation eenheid. De uitstroom-carbogenation helpt bij het stabiliseren van het zuurstofniveau in experimenten die afhankelijk zijn van de recycling van een kleine buffer reservoir ter verbetering van de kostenefficiëntie van de drug experimenten. Daarnaast presenteert het manuscript representatieve experimenten die onderzoeken van de effecten van verschillende carbogenation wijzen en stimulatie paradigma’s op de activiteit-afhankelijke synaptische plasticiteit van synaptische transmissie.
Introduction
In 1951 waren de eerste gerapporteerde acute hersenen segment experimenten uitgevoerd1. In 1971, na succesvolle in vitro opnames uit de3 van piriform cortex2,en de ontdekking dat hippocampal neuronen onderling dwars langs de as van de septotemporal van de hippocampus4, één van verbonden de eerste in vitro opnames van hippocampal Neuronale activiteit werd bereikt5. De gelijkenis van de neurofysiologische of neurostructural parameters van neuronen in vivo es in vitro voorwaarden zijn nog steeds het onderwerp van een debat6, maar in 1975, Schwartzkroin7 aangegeven dat de basale eigenschappen van neuronen in vitro worden gehandhaafd en dat hoogfrequente stimulatie (dat wil zeggen, tetanization) van afferents in de hippocampal formatie induceert een langdurige versoepeling van synaptic potentieel8. Elektrofysiologische opname van neuronale activiteit in vitro breidde de studie van de cellulaire mechanismen van activiteit-afhankelijke synaptische plasticiteit9,10, die had ontdekt in 1973 door Bliss et al. 11 de vivo experimenten met konijnen.
De studie van neuronale activiteit of signalering trajecten in plakjes van de hersenen, met name in acute hippocampal segmenten, is nu een standaard tool. Verrassend, moeten in vitro experimenten echter nog worden herleid, zoals blijkt uit de verschillende benaderingen die nog steeds bestaan voor de opstelling en het onderhoud van acute hippocampal segmenten. Reid et al. (1988) 12 herzien de methodologische uitdagingen voor het onderhoud van acute hersenen segmenten in verschillende soorten segment kamers en de keuzes van het medium, pH, temperatuur en zuurstof niveau zwemmen. Deze parameters zijn nog steeds moeilijk te controleren in de zaal van de opname als gevolg van de op maat gemaakte elementen van in vitro segment-opname opstellingen. Publicaties kunnen worden gevonden dat misschien help te overwinnen enkele van de methodologische uitdagingen en die nieuwe soorten beschreven onderdompeling segment chambers, zoals een interstitiële 3D microperfusion systeem13, een kamer met verbeterde laminaire flow en zuurstof 14, een systeem met geautomatiseerde temperatuur controle15, en een multi-kamer opname systeem16opgeven. Aangezien deze kamers zijn niet gemakkelijk op te bouwen, rekenen de meeste wetenschappers op verkrijgbare segment kamers. Deze kamers kunnen worden gemonteerd op een Microscoop systeem, waardoor de combinatie van elektrofysiologie en fluorescentie imaging17,18,19. Aangezien deze kamers houden de segmenten van de hersenen ondergedompeld in kunstmatige cerebrospinale vloeistof (aCSF), moet een hoog stroomtarief bufferoplossing worden gehandhaafd, verhoging van de kosten van de toepassing van de drug. Daartoe hebben we een recyclingsysteem perfusie met uitstroom-carbogenation waarmee voldoende stabiliteit voor de lange termijn opname van veld potentieel in een onderdompeling segment kamer met behulp van een relatief kleine aCSF volume opgenomen. Bovendien, samengevat we hoe het gebruik van deze experimentele carbogenation/perfusie-systeem de uitkomst van de Synaptische plasticiteit activiteit-afhankelijke10 beïnvloedt en hoe remming van eukaryotische rek factor-2 kinase (eEF2K) moduleert synaptic transmissie20.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hoewel de interface segment chambers vertonen meer robuuste synaptic reacties25,26,27,28, bieden onderdompeling kamers extra gemak voor patch-clamp opname en fluorescentie Imaging. Zo hebben we verschillende aspecten van veldopnames potentiële in acute hippocampal plakjes met behulp van een commerciële onderdompeling segment kamer die gemakkelijk kan worden uitgebreid tot de beeldvorming van …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
W.W. uitgevoerd, geanalyseerd, en de experimenten ontworpen en schreef het manuscript. D.X. en C.P. bijgestaan in figuur voorbereiding en de experimenten. Dit werk werd gesteund door NSFC (31320103906) en T.B.-111 Project (B16013)
Materials
| Reagents required | |||
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10019318 | |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10016318 | |
| KH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10017618 | |
| MgCl2·6H2O | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10012818 | |
| CaCl2 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10005861 | |
| NaHCO3 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10018960 | |
| Glucose | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10010518 | |
| NaH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 20040718 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | A4043 | |
| MgSO4 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 20025118 | |
| NaOH | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10019718 | |
| Tools and materials for dissection | |||
| Decapitators | Harvard apparatus | 55-0012 | for rat decapitation |
| Bandage Scissors | SCHREIBER | 12-4227 | for mouse decapitation |
| double-edge blade | Flying Eagle, China | 74-C | |
| IRIS Scissors | RWD, China | S12003-09 | |
| Bone Rongeurs | RWD, China | S22002-14 | |
| Spoon | Hammacher | HSN 152-13 | |
| dental cement spatula | Hammacher | HSN 016-15 | |
| dental double end excavator | Blacksmith Surgical, USA | BS-415-017 | |
| Vibrating Microtome | Leica, Germany | VT1200S | |
| surgical blade | RWD, China | S31023-02 | |
| surgical holder | RWD, China | S32007-14 | |
| Electrophysiology equipment and materials | |||
| Vertical Pipette Puller | Narishige, Japan | PC-10 | |
| Vibration isolation table | Meirits, Japan | ADZ-A0806 | |
| submerged type recording chamber | Warner Instruments | RC-26GLP | |
| thermostatic water bath | Zhongcheng Yiqi，China | HH-1 | |
| 4 Axis Micromanipulator | Sutter, USA | MP-285, MP-225 | |
| Platinum Wire | World Precision Instruments | PTP406 | |
| Amplifier | Molecular Devices, USA | Multiclamp 700B | |
| Data Acquisition System | Molecular Devices, USA | Digidata 1440A | |
| Anaysis software | Molecular Devices, USA | Clampex 10.2 | |
| Fluorescence Microscope | Nikon, Japan | FN1 | |
| LED light source | Lumen Dynamics Group, Canada | X-cite 120LED | |
| micropipettes | Harvard apparatus | GC150TF | extracelluar recording |
| borosilicate micropipettes | Sutter, USA | BF150-86 | patch clamp |
| tungsten electrode | A-M Systems, USA | 575500 | |
| peristaltic pump | Longer, China | BT00-300T | |
| tubes for peristaltic pump | ISMATEC, Wertheim, Germany | SC0309 | 1x inflow, ID: 1.02mm |
| tubes for peristaltic pump | ISMATEC, Wertheim, Germany | SC0319 | 2x tubes for outflow, ID: 2.79 mm |
| CCD camera | PCO, Germany | pco.edge sCMOS | |
| lens cleaning paper | Kodak | ||
| 50 ml conical centrifuge tube | Thermo scientific | 339652 | |
| Prechamber | Warner Instruments | BSC-PC | |
| Inline heater | Warner Instruments | SF-28 | |
| Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324B |
Referencias
- McIlwain, H. Metabolic response in vitro to electrical stimulation of sections of mammalian brain. Biochem J. 48 (4), (1951).
- McIlwain, H., Richards, C. D., Somerville, A. R. Responses in vitro from the piriform cortex of the rat, and their susceptibility to centrally-acting drugs. J Neurochem. 14 (9), 937-938 (1967).
- Yamamoto, C., McIlwain, H. Electrical activities in thin sections from the mammalian brain maintained in chemically-defined media in vitro. J Neurochem. 13 (12), 1333-1343 (1966).
- Andersen, P., Bliss, T. V., Lomo, T., Olsen, L. I., Skrede, K. K. Lamellar organization of hippocampal excitatory pathways. Acta Physiol Scand. 76 (1), 4-5 (1969).
- Skrede, K. K., Westgaard, R. H. The transverse hippocampal slice: a well-defined cortical structure maintained in vitro. Brain Res. 35 (2), 589-593 (1971).
- Kirov, S. A., Sorra, K. E., Harris, K. M. Slices have more synapses than perfusion-fixed hippocampus from both young and mature rats. J Neurosci. 19 (8), 2876-2886 (1999).
- Schwartzkroin, P. A. Characteristics of CA1 neurons recorded intracellularly in the hippocampal in vitro slice preparation. Brain Res. 85 (3), 423-436 (1975).
- Schwartzkroin, P. A., Wester, K. Long-lasting facilitation of a synaptic potential following tetanization in the in vitro hippocampal slice. Brain Res. 89 (1), 107-119 (1975).
- Reymann, K. G., Frey, J. U. The late maintenance of hippocampal LTP: requirements, phases, ‘synaptic tagging’, ‘late-associativity’ and implications. Neuropharm. 52 (1), 24-40 (2007).
- Bliss, T. V., Collingridge, G. L., Morris, R. G. Synaptic plasticity in health and disease: introduction and overview. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 369 (1633), 20130129 (2014).
- Bliss, T. V., Gardner-Medwin, A. R. Long-lasting potentiation of synaptic transmission in the dentate area of the unanaestetized rabbit following stimulation of the perforant path. J Physiol. 232 (2), 357-374 (1973).
- Reid, K. H., Edmonds, H. L., Schurr, A., Tseng, M. T., West, C. A. Pitfalls in the Use of Brain-Slices. Prog Neurobiol. 31 (1), 1-18 (1988).
- Rambani, K., Vukasinovic, J., Glezer, A., Potter, S. M. Culturing thick brain slices: an interstitial 3D microperfusion system for enhanced viability. J Neurosci Methods. 180 (2), 243-254 (2009).
- Hajos, N., et al. Maintaining network activity in submerged hippocampal slices: importance of oxygen supply. Eur J Neurosci. 29 (2), 319-327 (2009).
- Redondo, R. L., et al. Synaptic tagging and capture: differential role of distinct calcium/calmodulin kinases in protein synthesis-dependent long-term potentiation. J Neurosci. 30 (14), 4981-4989 (2010).
- Stopps, M., et al. Design and application of a novel brain slice system that permits independent electrophysiological recordings from multiple slices. J Neurosci Methods. 132 (2), 137-148 (2004).
- Behnisch, T., Matsushita, S., Knopfel, T. Imaging of gene expression during long-term potentiation. Neuroreport. 15 (13), 2039-2043 (2004).
- Karpova, A., et al. Encoding and transducing the synaptic or extrasynaptic origin of NMDA receptor signals to the nucleus. Cell. 152 (5), 1119-1133 (2013).
- Karpova, A., Mikhaylova, M., Thomas, U., Knopfel, T., Behnisch, T. Involvement of protein synthesis and degradation in long-term potentiation of Schaffer collateral CA1 synapses. J Neurosci. 26 (18), 4949-4955 (2006).
- Weng, W., Chen, Y., Wang, M., Zhuang, Y., Behnisch, T. Potentiation of Schaffer-Collateral CA1 Synaptic Transmission by eEF2K and p38 MAPK Mediated Mechanisms. Front Cell Neurosci. 10 (247), (2016).
- Meduna, L. J., Jackman, A. I. Carbon dioxide inhalation therapy. Res Publ Assoc Res Nerv Ment Dis. 31, 280-286 (1953).
- Edwards, F. A., Konnerth, A., Sakmann, B., Takahashi, T. A thin slice preparation for patch clamp recordings from neurones of the mammalian central nervous system. Pflugers Arch. 414 (5), 600-612 (1989).
- Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology. J Vis Exp. (49), (2011).
- Yuanxiang, P., Bera, S., Karpova, A., Kreutz, M. R., Mikhaylova, M. Isolation of CA1 nuclear enriched fractions from hippocampal slices to study activity-dependent nuclear import of synapto-nuclear messenger proteins. J Vis Exp. (90), e51310 (2014).
- Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. LTP in cultured hippocampal-entorhinal cortex slices from young adult (P25-30) rats. J Neurosci Meth. 130 (1), 19-32 (2003).
- Kloosterman, F., Peloquin, P., Leung, L. S. Apical and basal orthodromic population spikes in hippocampal CA1 in vivo show different origins and patterns of propagation. J Neurophysiol. 86 (5), 2435-2444 (2001).
- Thiemann, W., Malisch, R., Reymann, K. G. A new microcirculation chamber for inexpensive long-term investigations of nervous tissue in vitro. Brain Res Bull. 17 (1), 1-4 (1986).
- Shetty, M. S., et al. Investigation of Synaptic Tagging/Capture and Cross-capture using Acute Hippocampal Slices from Rodents. J Vis Exp. (103), (2015).
- Du, H., Lin, J., Zuercher, C. Higher efficiency of CO2 injection into seawater by a venturi than a conventional diffuser system. Bioresour Technol. 107, 131-134 (2012).
- Weinman, J., Mahler, J. An Analysis of Electrical Properties of Metal Electrodes. Med Electron Biol Eng. 2, 299-310 (1964).
- Fanselow, M. S., Dong, H. W. Are the dorsal and ventral hippocampus functionally distinct structures. Neuron. 65 (1), 7-19 (2010).
- Wang, M., et al. Translation of BDNF-gene transcripts with short 3′ UTR in hippocampal CA1 neurons improves memory formation and enhances synaptic plasticity-relevant signaling pathways. Neurobiol Learn Mem. , (2016).
