הקלטה הפלסטיות הסינפטית בפרוסות בהיפוקמפוס חריפה, בהשתתפות של מיחזור - בנפח מצומצם, זלוף- ומערכת ועלייתו-סוג תא
Summary
פרוטוקול זה מתאר את הייצוב של רמת החמצן נפח קטן של מאגר ממוחזר, היבטים מתודולוגיים של הקלטה פלסטיות סינפטית תלויי-פעילות המשוקע פרוסות בהיפוקמפוס חריפה.
Abstract
אף-על-פי ניסויים על פרוסות המוח כבר בשימוש מאז 1951, בעיות להישאר זה לצמצם את ההסתברות להשגת ניתוח יציב וטוב של אפנון הסינאפסית בעת ביצוע הקלטות שדה פוטנציאלי או תאיים. כתב יד זה מתאר היבטים מתודולוגיים שיכול להועיל בשיפור תנאי ניסיוני עבור שמירה על פרוסות המוח חריפה, הקלטה שדה פוטנציאל postsynaptic סינאפסות בתוך תא צלילה זמינים מסחרית עם יחידת תזרים-carbogenation. יצוא-carbogenation מסייע לייצב את רמת החמצן בניסויים המסתמכים על מיחזור של מאגר מאגר קטן כדי לשפר את העלות-יעילות התרופה ניסויים. בנוסף, כתב היד מציג ניסויים נציג זה לבחון את ההשפעה של מצבים שונים carbogenation, גירויים פרדיגמות על הפלסטיות הסינפטית פעילות תלוית של ההעברה הסינאפסית.
Introduction
בשנת 1951, דיווח ראשון המוח חריפה פרוסה שהניסוי היה מתנהל1. ב-1971, לאחר מוצלחת במבחנה הקלטות מתוכנות piriform קליפת2,3 , הגילוי. נוירונים בהיפוקמפוס מחוברים באופן רוחבי לאורך ציר septotemporal של ההיפוקמפוס4, לאחד במבחנה הקלטות הראשונה של פעילות עצביים בהיפוקמפוס היתה מושגת5. הדמיון של הפרמטרים neurophysiological או neurostructural של נוירונים בתנאים בתוך vivo ו- in vitro לקשרי הם עדיין הנושא של הדיון מספר6, אבל בשנת 1975, Schwartzkroin7 עולה כי הבסיס מאפיינים של נוירונים נשמרים במבחנה ומשרה את גירוי בתדירות גבוהה (קרי: tetanization) של afferents במערך בהיפוקמפוס הקלה לטווח ארוך של סינאפטיים8. אלקטרופיזיולוגיות הקלטה של פעילות. עצבית במבחנה הרחיב את חקר המנגנונים הסלולר של פלסטיות סינפטית תלויי-פעילות9,10, אשר התגלה בשנת 1973 על ידי בליס et al. 11 de vivo ניסויים עם ארנבונים.
בחקר פעילות. עצבית או איתות המסלולים פרוסות המוח, ועל במיוחד-פרוסות בהיפוקמפוס חריפה, הוא עכשיו כלי סטנדרטי. עם זאת, באופן מפתיע, ניסויים במבחנה טרם להיות סטנדרטית, כפי שמעידים הגישות מרובים עדיין קיימים הכנה ותחזוקה של פרוסות בהיפוקמפוס חריפה. ריד. et al. (1988) 12 סקרו את אתגרים מתודולוגיים לשם קיום פרוסות המוח חריפה סוגים שונים של צ’יימברס פרוסה, הבחירות של רחצה ברמה בינונית, pH, טמפרטורה וחמצן. פרמטרים אלה הם עדיין קשה לשלוט בבית הבליעה הקלטה בשל היסודות במבחנה פרוסה-הקלטה setups בהזמנה אישית. הפרסומים ניתן למצוא כי עשוי לעזור להתגבר כמה אתגרים מתודולוגיים וכי לתאר סוגים חדשים של צ’יימברס פרוסה ועלייתו, כגון מערכת של interstitial 3D microperfusion13, תא עם זרימה שכבתית משופרת וחמצן אספקה14, מערכת עם בקרת טמפרטורה ממוחשבת15, מערכת הקלטה רב קאמרית16. מאז התאים האלו לא קל לבנות, רוב המדענים להסתמך על פרוסה זמינים מסחרית צ’יימברס. התאים האלה יכול להיות מותקן על מערכת מיקרוסקופ, ובכך מאפשר עבור שילוב אלקטרופיזיולוגיה עם פלורסצנטיות הדמיה17,18,19. מאז התאים האלה לשמור את פרוסות המוח שקוע בתוך נוזל מוחי שדרתי מלאכותי (כלנית חדד), קצב זרימה גבוהה של הפתרון המאגר צריך להיות מתוחזק, הגדלת ההוצאות של יישום סמים. לשם כך, אנו שילבו מערכת זלוף מיחזור עם תזרים-carbogenation המספק יציבות מספקת עבור הקלטה לטווח ארוך של שדה פוטנציאל בחדר ועלייתו פרוסה באמצעות אמצעי אחסון יצחק גרגיר קטן יחסית. בנוסף, נוכל לסכם כיצד השימוש של מערכת carbogenation ניסויית/זלוף זו משפיעה על התוצאה של פלסטיות סינפטית תלויי-פעילות10 , איך עיכוב של התארכות האיקריוטים פקטור-2 קינאז (eEF2K) ממיקרו סינפטית שידור20.
Protocol
Representative Results
Discussion
למרות ממשק פרוסה צ’יימברס התערוכה עמידים יותר תגובות סינפטית25,26,27,28, ועלייתו צ’יימברס לספק נוחות נוסף עבור תיקון-קלאמפ הקלטה של קרינה פלואורסצנטית הדמיה. לפיכך, שתיארנו מספר היבטים של הקלטות שדה פוטנציאל בפרוסות בהיפוק…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
וו. וו שנערך, ניתח, עיצב את הניסויים, כתב היד. D.X. סי בסיוע בהכנה איור, ערכו הניסויים. עבודה זו נתמכה על ידי NSFC (31320103906) ופרוייקט 111 (B16013) מתה משחפת
Materials
| Reagents required | |||
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10019318 | |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10016318 | |
| KH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10017618 | |
| MgCl2·6H2O | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10012818 | |
| CaCl2 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10005861 | |
| NaHCO3 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10018960 | |
| Glucose | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10010518 | |
| NaH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 20040718 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | A4043 | |
| MgSO4 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 20025118 | |
| NaOH | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10019718 | |
| Tools and materials for dissection | |||
| Decapitators | Harvard apparatus | 55-0012 | for rat decapitation |
| Bandage Scissors | SCHREIBER | 12-4227 | for mouse decapitation |
| double-edge blade | Flying Eagle, China | 74-C | |
| IRIS Scissors | RWD, China | S12003-09 | |
| Bone Rongeurs | RWD, China | S22002-14 | |
| Spoon | Hammacher | HSN 152-13 | |
| dental cement spatula | Hammacher | HSN 016-15 | |
| dental double end excavator | Blacksmith Surgical, USA | BS-415-017 | |
| Vibrating Microtome | Leica, Germany | VT1200S | |
| surgical blade | RWD, China | S31023-02 | |
| surgical holder | RWD, China | S32007-14 | |
| Electrophysiology equipment and materials | |||
| Vertical Pipette Puller | Narishige, Japan | PC-10 | |
| Vibration isolation table | Meirits, Japan | ADZ-A0806 | |
| submerged type recording chamber | Warner Instruments | RC-26GLP | |
| thermostatic water bath | Zhongcheng Yiqi，China | HH-1 | |
| 4 Axis Micromanipulator | Sutter, USA | MP-285, MP-225 | |
| Platinum Wire | World Precision Instruments | PTP406 | |
| Amplifier | Molecular Devices, USA | Multiclamp 700B | |
| Data Acquisition System | Molecular Devices, USA | Digidata 1440A | |
| Anaysis software | Molecular Devices, USA | Clampex 10.2 | |
| Fluorescence Microscope | Nikon, Japan | FN1 | |
| LED light source | Lumen Dynamics Group, Canada | X-cite 120LED | |
| micropipettes | Harvard apparatus | GC150TF | extracelluar recording |
| borosilicate micropipettes | Sutter, USA | BF150-86 | patch clamp |
| tungsten electrode | A-M Systems, USA | 575500 | |
| peristaltic pump | Longer, China | BT00-300T | |
| tubes for peristaltic pump | ISMATEC, Wertheim, Germany | SC0309 | 1x inflow, ID: 1.02mm |
| tubes for peristaltic pump | ISMATEC, Wertheim, Germany | SC0319 | 2x tubes for outflow, ID: 2.79 mm |
| CCD camera | PCO, Germany | pco.edge sCMOS | |
| lens cleaning paper | Kodak | ||
| 50 ml conical centrifuge tube | Thermo scientific | 339652 | |
| Prechamber | Warner Instruments | BSC-PC | |
| Inline heater | Warner Instruments | SF-28 | |
| Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324B |
Referencias
- McIlwain, H. Metabolic response in vitro to electrical stimulation of sections of mammalian brain. Biochem J. 48 (4), (1951).
- McIlwain, H., Richards, C. D., Somerville, A. R. Responses in vitro from the piriform cortex of the rat, and their susceptibility to centrally-acting drugs. J Neurochem. 14 (9), 937-938 (1967).
- Yamamoto, C., McIlwain, H. Electrical activities in thin sections from the mammalian brain maintained in chemically-defined media in vitro. J Neurochem. 13 (12), 1333-1343 (1966).
- Andersen, P., Bliss, T. V., Lomo, T., Olsen, L. I., Skrede, K. K. Lamellar organization of hippocampal excitatory pathways. Acta Physiol Scand. 76 (1), 4-5 (1969).
- Skrede, K. K., Westgaard, R. H. The transverse hippocampal slice: a well-defined cortical structure maintained in vitro. Brain Res. 35 (2), 589-593 (1971).
- Kirov, S. A., Sorra, K. E., Harris, K. M. Slices have more synapses than perfusion-fixed hippocampus from both young and mature rats. J Neurosci. 19 (8), 2876-2886 (1999).
- Schwartzkroin, P. A. Characteristics of CA1 neurons recorded intracellularly in the hippocampal in vitro slice preparation. Brain Res. 85 (3), 423-436 (1975).
- Schwartzkroin, P. A., Wester, K. Long-lasting facilitation of a synaptic potential following tetanization in the in vitro hippocampal slice. Brain Res. 89 (1), 107-119 (1975).
- Reymann, K. G., Frey, J. U. The late maintenance of hippocampal LTP: requirements, phases, ‘synaptic tagging’, ‘late-associativity’ and implications. Neuropharm. 52 (1), 24-40 (2007).
- Bliss, T. V., Collingridge, G. L., Morris, R. G. Synaptic plasticity in health and disease: introduction and overview. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 369 (1633), 20130129 (2014).
- Bliss, T. V., Gardner-Medwin, A. R. Long-lasting potentiation of synaptic transmission in the dentate area of the unanaestetized rabbit following stimulation of the perforant path. J Physiol. 232 (2), 357-374 (1973).
- Reid, K. H., Edmonds, H. L., Schurr, A., Tseng, M. T., West, C. A. Pitfalls in the Use of Brain-Slices. Prog Neurobiol. 31 (1), 1-18 (1988).
- Rambani, K., Vukasinovic, J., Glezer, A., Potter, S. M. Culturing thick brain slices: an interstitial 3D microperfusion system for enhanced viability. J Neurosci Methods. 180 (2), 243-254 (2009).
- Hajos, N., et al. Maintaining network activity in submerged hippocampal slices: importance of oxygen supply. Eur J Neurosci. 29 (2), 319-327 (2009).
- Redondo, R. L., et al. Synaptic tagging and capture: differential role of distinct calcium/calmodulin kinases in protein synthesis-dependent long-term potentiation. J Neurosci. 30 (14), 4981-4989 (2010).
- Stopps, M., et al. Design and application of a novel brain slice system that permits independent electrophysiological recordings from multiple slices. J Neurosci Methods. 132 (2), 137-148 (2004).
- Behnisch, T., Matsushita, S., Knopfel, T. Imaging of gene expression during long-term potentiation. Neuroreport. 15 (13), 2039-2043 (2004).
- Karpova, A., et al. Encoding and transducing the synaptic or extrasynaptic origin of NMDA receptor signals to the nucleus. Cell. 152 (5), 1119-1133 (2013).
- Karpova, A., Mikhaylova, M., Thomas, U., Knopfel, T., Behnisch, T. Involvement of protein synthesis and degradation in long-term potentiation of Schaffer collateral CA1 synapses. J Neurosci. 26 (18), 4949-4955 (2006).
- Weng, W., Chen, Y., Wang, M., Zhuang, Y., Behnisch, T. Potentiation of Schaffer-Collateral CA1 Synaptic Transmission by eEF2K and p38 MAPK Mediated Mechanisms. Front Cell Neurosci. 10 (247), (2016).
- Meduna, L. J., Jackman, A. I. Carbon dioxide inhalation therapy. Res Publ Assoc Res Nerv Ment Dis. 31, 280-286 (1953).
- Edwards, F. A., Konnerth, A., Sakmann, B., Takahashi, T. A thin slice preparation for patch clamp recordings from neurones of the mammalian central nervous system. Pflugers Arch. 414 (5), 600-612 (1989).
- Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology. J Vis Exp. (49), (2011).
- Yuanxiang, P., Bera, S., Karpova, A., Kreutz, M. R., Mikhaylova, M. Isolation of CA1 nuclear enriched fractions from hippocampal slices to study activity-dependent nuclear import of synapto-nuclear messenger proteins. J Vis Exp. (90), e51310 (2014).
- Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. LTP in cultured hippocampal-entorhinal cortex slices from young adult (P25-30) rats. J Neurosci Meth. 130 (1), 19-32 (2003).
- Kloosterman, F., Peloquin, P., Leung, L. S. Apical and basal orthodromic population spikes in hippocampal CA1 in vivo show different origins and patterns of propagation. J Neurophysiol. 86 (5), 2435-2444 (2001).
- Thiemann, W., Malisch, R., Reymann, K. G. A new microcirculation chamber for inexpensive long-term investigations of nervous tissue in vitro. Brain Res Bull. 17 (1), 1-4 (1986).
- Shetty, M. S., et al. Investigation of Synaptic Tagging/Capture and Cross-capture using Acute Hippocampal Slices from Rodents. J Vis Exp. (103), (2015).
- Du, H., Lin, J., Zuercher, C. Higher efficiency of CO2 injection into seawater by a venturi than a conventional diffuser system. Bioresour Technol. 107, 131-134 (2012).
- Weinman, J., Mahler, J. An Analysis of Electrical Properties of Metal Electrodes. Med Electron Biol Eng. 2, 299-310 (1964).
- Fanselow, M. S., Dong, H. W. Are the dorsal and ventral hippocampus functionally distinct structures. Neuron. 65 (1), 7-19 (2010).
- Wang, M., et al. Translation of BDNF-gene transcripts with short 3′ UTR in hippocampal CA1 neurons improves memory formation and enhances synaptic plasticity-relevant signaling pathways. Neurobiol Learn Mem. , (2016).
