Aislamiento de los mioblastos humanos, evaluación de la diferenciación miogénica y medición de la entrada de calcio almacenada

Los músculos esqueléticos humanos están compuestos de grupos de fibras musculares contráctiles, multinucleadas, resultantes de la fusión de células precursoras miogénicas. Los músculos esqueléticos tienen la capacidad de regenerarse después de la lesión gracias a la presencia de SC, las células madre del músculo esquelético situadas entre la membrana plasmática de las miofibras (sarcolemma) y la lámina basal. En el músculo no lesionado, los SC están presentes en su mayoría en estado de reposo. En respuesta al estrés mecánico oa la lesión, los SC se activan (mioblastos), proliferan y experimentan diferenciación para formar nuevas miofibras o auto-renovación para reponer el grupo SC ^{1 , 2} . A lo largo de los años, se desarrollaron varias técnicas para aislar los CS y su progenie, los mioblastos, de las biopsias del músculo esquelético. Con la mayor comprensión de los marcadores de superficie celular expresados ​​en estas células y la metodología de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) ^{3, 4 , 5} , ahora es posible aislar poblaciones puras de mioblastos humanos a partir de muestras musculares.

La señalización del calcio regula el desarrollo del músculo esquelético, la homeostasis y la regeneración. En particular, la entrada de Ca2 ⁺ que se activa después del agotamiento de la tienda intracelular, llamada SOCE, es de gran importancia ⁶ para estos procesos. Tras la estimulación celular, disminuye el nivel de Ca ^{2 +} en el retículo endo / sarcoplasmático (ER / SR), lo que a su vez activa los canales de Ca ^{2+ de} la membrana plasmática que permiten la entrada de Ca ²⁺ para rellenar el ER / SR ⁷ . Las dos principales proteínas implicadas en SOCE son el ER / SR Ca ^{2 +} -sensing stromal interacción molécula 1 (STIM1) de proteínas y la membrana plasmática Ca ^{2 +} canal Orai1. El músculo esquelético expresa abundantemente estas dos proteínas, así como otras proteínas de las mismas familias (STIM2 aNd Orai2-Orai3) ^{8 , 9} y varios canales permeables al Ca2 ⁺ de la familia canónica de potencial transitorio del receptor (TRPC) ^{10 , 11 , 12 , 13} . Ca ^{2 +} entrada a través de la vía SOCE es de gran importancia para la formación muscular / regeneración [ ^14] . Mutaciones de STIM1 o Orai1 proteínas tienen efectos nocivos sobre la función muscular, lo que conduce principalmente a la hipotonía muscular [ ^15] . Los modelos animales con deterioro de SOCE también muestran menor masa muscular y fuerza, junto con una mayor fatigabilidad ^{6 , 16 , 17} . Como se mencionó, otras proteínas STIM y Orai, así como muchos canales TRPC, se expresan en el músculo esquelético, y sus funciones respectivas no se han determinado hasta el momento. GolpeandoSu nivel de expresión, es posible investigar sus implicaciones en SOCE y sus funciones durante la diferenciación del músculo esquelético humano.

La medición de SOCE puede realizarse utilizando dos enfoques diferentes: registros de corriente electrofisiológica y mediciones de Ca ²⁺ . La electrofisiología es ciertamente un método más directo, ya que mide la corriente de interés y su firma electrofisiológica asociada. Sin embargo, esta técnica es muy difícil de aplicar a las células musculares, principalmente debido al gran tamaño de las células musculares y el pequeño tamaño de la corriente SOCE endógena. La obtención de imágenes de Ca ²⁺ citosólica es técnicamente muy accesible, pero la medida es más indirecta, ya que el nivel de Ca ²⁺ medido en el citosol refleja tanto la entrada de Ca ²⁺ como el re-bombeo fuera de la célula o en los almacenes internos.

Una metodología que incluye el aislamiento de mioblastos a partir de pequeñas piezas de skel humanoEtal después de digestión enzimática, amplificación y FACS se explica en este trabajo. Se describe el proceso de diferenciación muscular y el protocolo de inmunofluorescencia para seguir la expresión de marcadores de diferenciación con el tiempo ¹⁸ . Finalmente, se explican las medidas de SOCE y el papel de diferentes canales iónicos en la señalización de Ca ²⁺ y en la diferenciación del músculo esquelético.