기계 조직 해리 및 유동 세포 계측법에 의한 포유 동물 수컷 세포의 다중 종 정제에 대한 표준화 된 접근법
Summary
이 연구는 다른 포유 동물 종의 고환 조직으로부터 정제 된 배아 세포 집단을 얻는 방법의 표준화를 기술한다. Hoechst-33342 및 propidium iodide로 염색하는 기계적 고환 해리와 남성 생식 생물학의 비교 연구에서 폭넓게 응용할 수있는 FACS 분류법을 결합한 간단한 프로토콜입니다.
Abstract
Fluorescence-activated cell sorting (FACS)은 포유류 고환 세균 세포의 풍부한 개체군을 분리하는 방법 중 하나였습니다. 현재, 그것은 높은 수율과 순도로 9 마리의 쥐과세 세포 집단의 차별을 허용합니다. 이 차별화와 정화의 고해상도는 정자 형성을 통한 염색질 구조와 양의 독특한 변화로 인해 가능합니다. 이러한 패턴은 Hoechst-33342 (Hoechst)와 같은 형광 DNA 결합 염색 물로 염색 된 수컷 생식 세포의 유동 세포 계측법으로 포착 할 수 있습니다. 포유류 고환 세균 세포를 분리하기 위해 최근 개발 된 프로토콜에 대한 상세한 설명이 여기에있다. 간단히 말해, 단세포 현탁액은 기계적 해리에 의해 고환 조직으로부터 생성되고, 호 에스트 (Hoechst) 및 요오드화 프로피 듐 (PI)으로 이중 염색되고 유동 세포 계측법에 의해 처리된다. 상이한 DNA 함량 (Hoechst 강도)을 갖는 살아있는 세포 (PI 음성)의 선택을 포함한 일련의 게이팅 전략, 즉FACS 분류 과정에서 5 개의 배아 세포 유형을 구별하기 위해 사용됩니다. spermatogonia (66 %), primary (71 %) 및 secondary (85 %) spermatocytes 및 spermatids (90 %)를 포함하여 평균 순도 (현미경으로 평가) (87 %)의 하위 집단. 전체 워크 플로우를 실행하는 것은 간단하며 적절한 FACS 시스템으로 4 가지 세포 유형을 동시에 분리 할 수 있으며 2 시간 이내에 수행 할 수 있습니다. 처리 시간 단축은 생체 내 생체 의 생리학을 보존하는 데 중요 하므로이 방법은 남성 생식 세포 생물학에 대한 하류 고 처리량 연구에 이상적입니다. 또한, 포유류 배아 세포의 다중 종 (multispecies) 정화를위한 표준화 된 프로토콜은 방법 론적 변수의 출처를 제거하고 상이한 동물 모델에 대해 단일 세트의 시약을 사용할 수있게한다.
Introduction
spermatogenesis progression을 나타내는 in vitro system이 부족하고 testis에 세포 이종성이 존재한다는 점을 감안할 때 수컷 생식 세포 생물학에 대한 연구에서는 특정 세포 유형의 농축 된 개체군을 단리하기위한 강력한 기술이 필요합니다. Fluorescence-activated cell sorting (FACS)은 높은 수율과 순도를 제공하고 식별 할 수있는 배양 세포 유형의 수에서 다른 단리 방법을 능가하므로이 목적을 위해 1 , 2 , 3 , 4 , 5 로 널리 사용되었습니다. 6 , 7 , 8을 선택하십시오. 유세포 분석의 원리는 단일 세포의 레이저 빔 여기 이후의 차동 빛 패턴의 검출에 기초합니다. 세포가 레이저를 통과함에 따라 빛을 반사 / 산란시킵니다.모든 각도에서 세포 크기 (전방 산란; FSC) 및 세포 내 복잡성 (측방 산란; SSC)에 비례한다. 유동 세포 계측법에 대한 자세한 내용은 Ormerod 9 를 참조하십시오.
남성 생식 세포는 정자 형성의 여러 단계에 걸쳐 DNA 함량, 염색질 구조, 크기 및 모양에 특별한 변형을합니다. 따라서 뚜렷한 세포 집단은 형광 염료 10 , 11로 빛의 산란과 DNA 염색을 결합하여 확인하고 분리 할 수 있습니다. 몇몇 염료는 종종 10 지난 십 1, 2, 4 고환 세포의 유동 세포 계측법 분석에 사용 된 이러한 목적 등의 Hoechst-33342 (헥스)로서, (Geisinger 그리고 로드리게스-Casuriaga 3에서 검토)에 사용될 수있다 , 12 . 우포UV- 빛을 이용한 여기 Hoechst는 세포 DNA의 내용에 비례하여 청색 형광을 방출하는 반면, 원적외선 형광은 염색질 구조 및 압축 1 , 13 , 14의 가변성을 반영합니다. 그 결과, 분화의 다양한 단계에서 남성 생식 세포는 훽스트 염색 단일 세포 현탁액 FACS 동안 특정 패턴을 나타낸다 (호 FACS-1, 12). 흥미롭게도, 정자 단계에서만 활성화되는 색소 유출의 메커니즘으로 인해, Hoechst blue 형광의 강도는이 세포의 염색질 함량에 비례하지 않으며, Ho-FACS 15 동안 부작용으로 분류됩니다. 또한 Hoechst 염색을 비 침투성 염료 propidium iodide (PI)와 결합하면 사용자가 FACS 1 < 1 일 때 죽은 (PI 양성) 세포와 생체 (PI 음성)를 구별 할 수 있습니다.2 , 10 , 12 이다. 이전 유세포에서 사용되고 이러한 전략은 고환 생식 세포의 분석 및 감수 I 1, 2, 4, 16의 4 가지 단계의 세포를 포함 9 개 생식 세포 유형까지 판별 마우스에서 광범위하게 최적화. 이 작품의 목적을 위해, Hoechst 염색법은 세 가지 주요 장점이 있습니다. 먼저, Ho-FACS는 마우스 모델 1 , 2 , 12 및 기타 쥐 (rat 및 쥐 돼지 17 , 18 , 19) 의 남성 생식 세포의 분리에 성공적으로 적용되었습니다. 둘째, Hoechst는 세포 투과성 염료이며 막 투과성을 필요로하지 않으므로 보존제가됩니다ves cell integrity. 마지막으로 Hoechst가 poly (d [AT]) DNA 서열 1 , 20 에 우선적으로 결합하기 때문에 RNase 처리가 필요하지 않다. RNA가 보존되고 DNA와 단백질 이외에 세균의 추가 하류 분자 연구에 사용될 수 있음을 의미한다 세포 분화.
포유류 종의 유동 세포 계측법 분석 (Geisinger and Rodriguez-Casuriaga 3 에서 검토 됨)에서 관찰 된 DNA 배수성 및 / 또는 염색성의 유사성에도 불구하고, 유동 세포 계측법에 의한 수컷 배아 세포 분리에 대해 설명 된 프로토콜에는 상당한 다양성이있었습니다. 여러 연구에서 조직 해리에 대한 특정 프로토콜을 사용하고 주로 마우스, 쥐 및 기니피그 등 다양한 모델 유기체에서 별개의 DNA 결합 염료 (단독 또는 조합)와 FACS 게이팅 전략을 사용했습니다. 따라서 서로 다른 종에 대해 수집 된 자료를 직접 비교하는 것은 unacco의 영향을받을 수 있습니다방법론 사이의 다양성으로 인한 기술적 인 유물이 없습니다. 중요한 것은 포유류 정자 형성 (2N – 4N – 2N – 1N)에 걸쳐 염색질 동력학의 놀라운 보존은 표준화 된 프로토콜이 다양한 포유류 종에 횡 방향으로 적용될 수 있음을 시사합니다.
이 연구의 목표는 결합하고, 20 이전에 출판 기술 (2)를 적용하여, 다른 포유 동물 종에 적용 할 수있는 하나의 워크 플로우를 개발하는 것이 었습니다. 조직 처리하기위한 방법의 표준화는 효소 분해에 필요한 5 종 특이 조정에 대한 필요성을 해결하기 위해 기계적 분해를 수행함으로써 달성되었다. 설치류 고환 조직의 기계적 해리가 두 가지 방법으로 생성 된 단일 세포 현탁액의 효소 조직 소화 20 및 Ho-FACS보다 우수한 것으로 나타났습니다그것과 비교 가능한 결과 5 . 원칙 증명으로이 프로토콜은 최대 5 개의 생식 세포 집단을 분리하는데 사용 된 설정을 기술합니다 : spermatogonia (SPG); 1 차 (SPC I) 및 2 차 spermatocytes (SPC II) 및 spermatids (SPD) – 라운드 (rSPD) 및 연장 (eSPD). 중요한 것은 조직 해부 및 UV 레이저가 장착 된 셀 분류기에 대한 액세스 시스템이 주요 요구 사항 인 실험실에서 쉽게 구현할 수 있다는 것입니다. 이 작업 흐름 ( 그림 1 )은 빠르고 간단하며 2 시간 이내에 새로운 고환 조직에서 4 개의 배아 세포 집단을 동시에 격리 할 수 있습니다. 감소 된 처리 시간은 추가 다운 스트림 절차를 위해 셀룰러 무결성을 유지하는 데 중요합니다. 더욱이 5 종의 다른 종에서의 성공적인 수행은 포유 동물의 clade 내에 광범위하게 적용될 수 있음을 시사하며 포유 동물의 남성 생식 기관의 비교 연구를 위해 생식 세포를 분리하는 이상적인 방법으로 만든다ogy.
이 프로토콜은 준비 단계를 제외하고 세 가지 주요 섹션으로 구성되어 있습니다 : (1) 고환 조직의 기계적 해리 및 (2) Hoechst 및 PI와의 고환 세포 염색, (3) 관련 정자 세포의 FACS 분류. 일단 포집되면, 다양한 포유류 고환 세균 세포의 이러한 풍부한 개체군은 광범위한 적용 분야에 사용될 수 있습니다. 이 프로토콜은 많은 다른 포유 동물 종에서 남성의 배아 세포를 정화하는 "모든 크기에 맞는"해리 방법을 설명합니다. 격리 된 생식 세포로 수행하고자하는 연구 유형에 따라 다른 배지 또는 완충액을 사용할 수 있습니다. 다음 프로토콜 단계는 하나의 전체 쥐의 정소에서 단일 세포 현탁액을 생성하는 것입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
포유 동물의 정자 형성 과정에서 고도로 보존 된 염색질 동역학을 고려할 때,이 연구의 목적은 다른 포유류 고환 조직과는 다른 분화 단계에서 남성 생식 세포를 분리하는 프로토콜을 개발하는 것이 었습니다 ( 그림 1 ). 다른 동물 모델에 단일 작업 흐름을 적용하는 데있어 주요 장애물 중 하나는 특히 조직 해리 프로토콜과 관련하여 종별 조정이 필요하다는 것입니다. 현재…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자들은 개 고환에 대한 Hillside Animal 병원 (St. Louis, MO)에 감사드립니다. 제이슨 아 랜드 (Jason Arand)와 테드 시세로 (Ted Cicero) 박사는 워싱턴 대학 (세인트 루이스 워싱톤 대학)에서 쥐의 고환 및 Brianne Tabers에게 수집을 돕기위한 실험실을 제공했습니다. Jared Hartsock과 WashU의 Dr. Salt 's Lab (기니 피그 고환 검사); 소형 돼지 고환에 대한 WashU의 비교 의학 부문의 Michael Talcott 박사. 저자들은 또한 직원이 운영하는 세포 분류 서비스를 제공하는 Siteman Flow Cytometry Core의 사용을 위해 워싱턴 주립대 학교의 Alvin J. Siteman Cancer Center와 St. Louis의 Barnes-Jewish Hospital을 인정했다. Siteman Cancer Center는 부분적으로 NCI Cancer Center Support Grant # P30 CA91842에서 지원됩니다.
이 연구는 미국 국립 보건원 (R01HD078641 및 R01MH101810 ~ D)의 보조금으로 FCT 박사 과정 (SFRH / BD / 51695 / 2011 to ACL)FC] 및 FCT 연구 계약서 [IF / 01262 / 2014 to AML]가 포함됩니다.
Materials
| 4% paraformaldehyde | VWR | #15710 | 4% PFA, For fixing sorted cells |
| Medimachine | BD Biosciences | #340588; | System for testis dissociation |
| 1X Dulbecco modified Eagle medium | Life Technologies | #31053 | DMEM, for testis dissociation |
| Medicon | BD Biosciences | #340591 | Disaggregation cartridge for testis dissociation |
| Fetal bovine serum | Thermo Scientific | #10082139 | FBS, for FACS ceollction |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | #H3570 | Hoecsht, For FACS staining |
| 40µm cell strainer | GREINER BIO-ONE | #89508-342 | For testis dissociation |
| 100x 15mm petri dish | Falcon | #351029 | For testis dissection |
| 5mL polypropylene round-bottom tubes | Falcon | #352063 | For FACS collection |
| 1.5mL Eppendorf tubes | VWR | #20170-650 | For FACS collection |
| 3mL needless syringe | BD Biosciences | #309657 | For testis dissociation |
| 50mL conical tube | MIDSCI | #C50R | For testis dissociation |
| Propidium Iodide | Invitrogen | #L7011 | PI, For FACS staining |
| MoFlo Legacy cell sorter | Beckman Coulter | #ML99030 | For FACS |
| Summit Cell Sorting software | Beckman Coulter | #ML99030 | For FACS |
| Phosphate buffered saline | Thermo Scientific | #AM9625 | PBS, For microscopy |
| Microscopic glass slide | Fisher Scientific | #12-544-4 | For microscopy |
| Glass coverslip | Fisher Scientific | #12-548-87 | For microscopy |
| Disposable transfer pipette (3mL) | Samco Scientific | #225 | For testis dissociation |
| DNase I | Roche | #10104159001 | For testis dissociation |
| Carbon steel surgical blade | Miltex | #4-111 | For testis dissection |
| Countess automated cell counter | Invitrogen | #C10227 | For automatic cell counting |
| Trypan blue solution (0.4%) | Sigma | #T8154 | For viability staining |
Referencias
- Bastos, H., et al. Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis. Cytometry A. 65 (1), 40-49 (2005).
- Gaysinskaya, V., Bortvin, A. Flow cytometry of murine spermatocytes. Curr Protoc Cytom. 72, (2015).
- Geisinger, A., Rodriguez-Casuriaga, R. Flow cytometry for gene expression studies in Mammalian spermatogenesis. Cytogenet Genome Res. 128 (1-3), 46-56 (2010).
- Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. Flow cytometry purification of mouse meiotic cells. J Vis Exp. (50), (2011).
- Lima, A. C., et al. Multispecies Purification of Testicular Germ Cells. Biol Reprod. , (2016).
- Bryant, J. M., Meyer-Ficca, M. L., Dang, V. M., Berger, S. L., Meyer, R. G. Separation of spermatogenic cell types using STA-PUT velocity sedimentation. J Vis Exp. (80), (2013).
- Chang, Y. F., Lee-Chang, J. S., Panneerdoss, S., MacLean, J. A., Rao, M. K. Isolation of Sertoli, Leydig, and spermatogenic cells from the mouse testis. Biotechniques. 51 (5), (2011).
- Margolin, G., Khil, P. P., Kim, J., Bellani, M. A., Camerini-Otero, R. D. Integrated transcriptome analysis of mouse spermatogenesis. BMC Genomics. 15, 39 (2014).
- Grogan, W. M., Farnham, W. F., Sabau, J. M. DNA analysis and sorting of viable mouse testis cells. J Histochem Cytochem. 29 (6), 738-746 (1981).
- Mays-Hoopes, L. L., Bolen, J., Riggs, A. D., Singer-Sam, J. Preparation of spermatogonia, spermatocytes, and round spermatids for analysis of gene expression using fluorescence-activated cell sorting. Biol Reprod. 53 (5), 1003-1011 (1995).
- Gaysinskaya, V., Soh, I. Y., van der Heijden, G. W., Bortvin, A. Optimized flow cytometry isolation of murine spermatocytes. Cytometry A. 85 (6), 556-565 (2014).
- Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J Exp Med. 183 (4), 1797-1806 (1996).
- Watson, J. V., Nakeff, A., Chambers, S. H., Smith, P. J. Flow cytometric fluorescence emission spectrum analysis of Hoechst-33342-stained DNA in chicken thymocytes. Cytometry. 6 (4), 310-315 (1985).
- Lassalle, B., et al. ‘Side Population’ cells in adult mouse testis express Bcrp1 gene and are enriched in spermatogonia and germinal stem cells. Development. 131 (2), 479-487 (2004).
- Omran, H. M., Bakhiet, M., Dashti, M. G. DNA integrity is a critical molecular indicator for the assessment of male infertility. Mol Med Rep. 7 (5), 1631-1635 (2013).
- Rodriguez-Casuriaga, R., Folle, G. A., Santinaque, F., Lopez-Carro, B., Geisinger, A. Simple and efficient technique for the preparation of testicular cell suspensions. J Vis Exp. (78), (2013).
- Rodriguez-Casuriaga, R., Geisinger, A., Santinaque, F. F., Lopez-Carro, B., Folle, G. A. High-purity flow sorting of early meiocytes based on DNA analysis of guinea pig spermatogenic cells. Cytometry A. 79 (8), 625-634 (2011).
- Rodriguez-Casuriaga, R., et al. Rapid preparation of rodent testicular cell suspensions and spermatogenic stages purification by flow cytometry using a novel blue-laser-excitable vital dye. MethodsX. 1, 239-243 (2014).
- Rodriguez-Casuriaga, R., et al. Ultra-fast and optimized method for the preparation of rodent testicular cells for flow cytometric analysis. Biol Proced Online. 11, 184-195 (2009).
- Hess, R. A., Renato de Franca, L. Spermatogenesis and cycle of the seminiferous epithelium. Adv Exp Med Biol. 636, 1-15 (2008).
- Zhao, H., Traganos, F., Dobrucki, J., Wlodkowic, D., Darzynkiewicz, Z. Induction of DNA damage response by the supravital probes of nucleic acids. Cytometry A. 75 (6), 510-519 (2009).
- Gassei, K., Ehmcke, J., Dhir, R., Schlatt, S. Magnetic activated cell sorting allows isolation of spermatogonia from adult primate testes and reveals distinct GFRa1-positive subpopulations in men. J Med Primatol. 39 (2), 83-91 (2010).
- Hayama, T., et al. Practical selection methods for rat and mouse round spermatids without DNA staining by flow cytometric cell sorting. Mol Reprod Dev. 83 (6), 488-496 (2016).
- Zhu, L., et al. FACS selection of valuable mutant mouse round spermatids and strain rescue via round spermatid injection. Zygote. 23 (3), 336-341 (2015).
