Cellules vivantes mesure d’odorants récepteur Activation en utilisant un essai en temps réel de cAMP

Le sens de l’odorat joue un rôle important dans la survie des animaux qu’ils comptent sur leurs capacités olfactives pour procurer de la nourriture, éviter les prédateurs et le danger, distinguer les espèces et sélectionnez mate^1,2. La réalisation de ces fonctions dépend les récepteurs odorants (RUP), qui sont exprimés individuellement à la surface ciliaire des neurones sensoriels olfactifs (OSNs) située dans l’épithélium olfactif (OE). SRO constitue la plus grande famille de la superfamille des récepteurs (GPCR) G-protéine a couplé avec environ 400 et 1200 divers OR gènes chez les humains et les souris, respectivement^3,4,5. RUP activé par odorisants conduire à une augmentation taux d’AMPc intracellulaires via l’activation séquentielle d’olfactif G-protéine (G_olf) et tapez III l’adénylyl cyclase (ACIII). L’augmentation qui en résulte du niveau d’AMPc intracellulaire pourrait fonctionner comme un second messager, qui ouvre le canal de nucléotides bloquées sur la surface des cellules, provoquant l’afflux des cations dont Ca^{2 +} et les potentiels d’action et le lancement en fin de compte neuro-potentiel transmission et perception olfactive. Le processus de détection et de discrimination un grand nombre de substances odorantes par ORs est considéré comme la première étape de la perception olfactive^6,7.

Étant donné que Buck et Axel⁸ tout d’abord avec succès cloné récepteurs odorants et élucidé le mécanisme de la perception olfactive initiée par ORs, deorphanization de la famille de l’OR est devenu l’un des points chauds dans ce domaine. Diverses méthodes in vivo, ex vivo et in vitro pour mesurer l’activation de l’OR ont été déclarés^9,10,11,12. Une méthode traditionnelle utilisée Ca^{2 +} imagerie suivie de single-cell RT-PCR sur OSNs permis l’identification de différents ORs à aliphatiques composés malodorants^13,14,15. Plus récemment, l’avènement des analyses à grande échelle transcriptome a favorisé le développement de méthodes plus haut débit en vivo . Le dosage de Kentucky identifié souris eugénol et muscone-favorisant l’ORs avec l’utilisation de la S100a5-tauGFP journaliste souris souche et microarray analysis⁹. Selon la diminution des niveaux d’ARNm de l’OR après exposition odorant, la technologie de rêve employé une approche transcriptomique afin de déterminer les profils activation OR dans les deux espèces de vertébrés et non-vertébré¹⁶. De même, compte tenu de la phosphorylation de S6 activations neuronales, la Matsunami groupe séquencée ARNm de ribosome phosphorylés immunoprécipitation pour identifier les réactifs ORs¹². Enfin, le groupe Feinstein a rapporté souris super renifleur qui pourraient servir de plate-forme pour étudier l’odeur codage en vivo, connu comme la technologie de MouSensor¹⁷.

Dans le domaine in vitro , le défi de la mise en culture OSNs a fait un système d’expression hétérologue qui imite ou expression fonctionnelle in vivo une solution idéale pour effectuer un dépistage à grande échelle de produits chimiques odorantes pour ORs. Néanmoins, étant donné que les lignées de cellules cultivées d’origines non-olfactifs diffèrent des OSNs natifs, ou protéines sont conservées dans le réticulum endoplasmique et incapable de faire le trafic vers la membrane plasmique, entraînant perte de récepteur fonction¹⁸ et la dégradation de l’OR ^{, 19}. pour résoudre ce problème, importants travaux ont été faits pour répliquer l’expression fonctionnelle d’OR sur la membrane cellulaire dans les lignées cellulaires hétérologue. Krautwurst et coll. d’abord attaché les 20 premiers acides aminés de la rhodopsine (Rho-tag) à la N-terminale de la protéine de l’OR et cela favorisé l’expression de la surface cellulaire de certains ORs de cellules humaines embryonnaires de rein (HEK)²⁰. En procédant à une analyse en série de (SAGE) Bibliothèque analyse l’expression génique de OSNs unique, Saito et al. tout d’abord cloné transportant des récepteurs protéiques (RTP) membres de la famille, RTP1 et RTP2 et la protéine réceptrice de l’enrichisseur expression 1 (REEP1) qui a facilité le trafic d’OR à la membrane cellulaire et améliorés de réponses véhiculées par les odorants des RUP dans les cellules HEK293T ²¹. se fondant sur ces constatations, le groupe Matsunami réussi à établir la lignée de cellules Hana3A, stablement transfected avec RTP1, RTP2, REEP1 et Gα_olf dans HEK293T et transitoirement transfectées avec ORs Rho-tag, efficaces ou fonctionnels expression. Les études ont révélé 1) une forme plus courte de RTP1, RTP1S, qui pourrait plus fermement favorisent ou fonction que la protéine originale de RTP1 et 2) le récepteur muscarinique de l’acétylcholine, type 3 (M3R) qui pourrait augmenter l’activité d’OR par l’intermédiaire de l’inhibition de la β-arrestine-2 recrutement, qui ont été introduits dans le système d’expression hétérologue pour optimiser expérimental sortie^22,23.

Plusieurs méthodes de détection ont été utilisés pour quantifier l’activation des récepteurs dans les systèmes hétérologues. Le dosage de la phosphatase alcaline placentaire sécrétées (SEAP) travaille avec une enzyme de journaliste transcriptionnellement réglementée par des éléments de réponse de l’AMPc (CREs), ce qui en fait une option intéressante pour évaluer l’activation de l’OR. La fluorescence est facilement détectée dans un échantillon de milieu de culture après l’incubation avec SEAP détection réactif²⁴. En utilisant cette méthode, les fonctions d’ORs comme une classe secondaire des récepteurs chemosensoriels exprimée dans la trace de OE-les récepteurs associés à amine (TAARs) ont été caractérisent^25,26,27. Une autre méthode courante, le dosage de la luciférase, utilise un gène rapporteur luciférase de firefly sous le contrôle de l’élément de réponse de l’AMPc (CRE). Luminescence générée par la production de la luciférase procure un moyen efficace et robuste de quantifier OR activation^10,11,28.

Des tests en temps réel de cAMP aussi sont sont répandues dans la surveillance dynamiquement la fonction des RCPG hétérologues ou endogènes. Un exemple de ces tests avancés tire parti d’une variante de biocapteur génétiquement codé, qui possède un domaine de liaison au cAMP fusionné à une forme mutante de la luciférase. Lorsque le cAMP se lie, le changement conformationnel aboutit à l’activation de la luciférase, luminescence d’où peut ensuite être mesurée avec un lecteur de chimiluminescence^29,30. La technologie en temps réel de cAMP a été signalée pour l’orphelin hors des récepteurs de l’odeur humaine dans les cellules HEK293 et NxG de 108CC15âne = « xref » > 31^,32,33, ainsi que dans le Hana3A dérivé de HEK293T cellules^34,35. Le groupe Krautwurst a également décrit en détail la technologie cAMP en temps réel afin de convenir aux bi-directionnel à grande échelle ou la projection des approches^32,33.

Nous décrivons ici un protocole permettant de mesurer l’activation d’OR à l’aide d’un essai en temps réel de cAMP dans les cellules Hana3A. Dans ce protocole, la luminescence des cellules vivantes préalablement équilibrés est cinétiquement mesurée pendant 30 min après le traitement par certains composés volatils, ce qui représente une analyse plus efficace et plus précise de l’activation d’OR qui sont moins sensibles aux artefacts qui se produisent dans l’environnement cellulaire avec temps prolongé et la toxicité cellulaire induite par l’odeur. Cette mesure en temps réel permet un dépistage à grande échelle des ORs et des ligands, ainsi que la caractérisation des paires d’OR-ligand spécifiques d’intérêt. En utilisant cette méthode, nous avons avec succès identifié OR5AN1 comme le récepteur de la muscone composés de musc en réalisant une projection contre 379 ORs humaines et en confirmant par la suite le résultat du dépistage positif.