Caractériser le fonctionnement des récepteurs odorants sert un élément indispensable dans le processus de deorphanization. Nous décrivons une méthode permettant de mesurer l’activation des récepteurs odorants en temps réel à l’aide d’un test de cAMP.
La taille énorme des familles mammifères odorant du récepteur (OR) présente des difficultés à trouver leurs ligands apparentés parmi de nombreux produits chimiques volatils. Pour efficacement et précisément deorphanize ORs, nous combinons l’utilisation d’une lignée de cellules hétérologues d’exprimer les mammifères ORs et un plasmide génétiquement modifié biocapteur permettant de mesurer la production d’AMPc en aval de l’activation d’OR en temps réel. Ce test peut être utilisé pour écran odorisants contre ORs et vice versa. Interactions positives odorant-récepteur à partir des écrans peuvent être confirmées par la suite en testant contre diverses concentrations d’odeurs, générant des courbes concentration-réponse. Ici, nous avons utilisé cette méthode pour effectuer un criblage à haut débit d’un composé odorant contre une bibliothèque OR humain exprimés dans les cellules Hana3A et a confirmé que le récepteur répond positivement est le récepteur apparenté du composé d’intérêt. Nous avons trouvé cette méthode de détection de haut débit pour être efficaces et fiables pour évaluer l’activation de l’OR et nos données fournissent un exemple de son utilisation possible dans les études fonctionnelles d’OR.
Le sens de l’odorat joue un rôle important dans la survie des animaux qu’ils comptent sur leurs capacités olfactives pour procurer de la nourriture, éviter les prédateurs et le danger, distinguer les espèces et sélectionnez mate1,2. La réalisation de ces fonctions dépend les récepteurs odorants (RUP), qui sont exprimés individuellement à la surface ciliaire des neurones sensoriels olfactifs (OSNs) située dans l’épithélium olfactif (OE). SRO constitue la plus grande famille de la superfamille des récepteurs (GPCR) G-protéine a couplé avec environ 400 et 1200 divers OR gènes chez les humains et les souris, respectivement3,4,5. RUP activé par odorisants conduire à une augmentation taux d’AMPc intracellulaires via l’activation séquentielle d’olfactif G-protéine (Golf) et tapez III l’adénylyl cyclase (ACIII). L’augmentation qui en résulte du niveau d’AMPc intracellulaire pourrait fonctionner comme un second messager, qui ouvre le canal de nucléotides bloquées sur la surface des cellules, provoquant l’afflux des cations dont Ca2 + et les potentiels d’action et le lancement en fin de compte neuro-potentiel transmission et perception olfactive. Le processus de détection et de discrimination un grand nombre de substances odorantes par ORs est considéré comme la première étape de la perception olfactive6,7.
Étant donné que Buck et Axel8 tout d’abord avec succès cloné récepteurs odorants et élucidé le mécanisme de la perception olfactive initiée par ORs, deorphanization de la famille de l’OR est devenu l’un des points chauds dans ce domaine. Diverses méthodes in vivo, ex vivo et in vitro pour mesurer l’activation de l’OR ont été déclarés9,10,11,12. Une méthode traditionnelle utilisée Ca2 + imagerie suivie de single-cell RT-PCR sur OSNs permis l’identification de différents ORs à aliphatiques composés malodorants13,14,15. Plus récemment, l’avènement des analyses à grande échelle transcriptome a favorisé le développement de méthodes plus haut débit en vivo . Le dosage de Kentucky identifié souris eugénol et muscone-favorisant l’ORs avec l’utilisation de la S100a5-tauGFP journaliste souris souche et microarray analysis9. Selon la diminution des niveaux d’ARNm de l’OR après exposition odorant, la technologie de rêve employé une approche transcriptomique afin de déterminer les profils activation OR dans les deux espèces de vertébrés et non-vertébré16. De même, compte tenu de la phosphorylation de S6 activations neuronales, la Matsunami groupe séquencée ARNm de ribosome phosphorylés immunoprécipitation pour identifier les réactifs ORs12. Enfin, le groupe Feinstein a rapporté souris super renifleur qui pourraient servir de plate-forme pour étudier l’odeur codage en vivo, connu comme la technologie de MouSensor17.
Dans le domaine in vitro , le défi de la mise en culture OSNs a fait un système d’expression hétérologue qui imite ou expression fonctionnelle in vivo une solution idéale pour effectuer un dépistage à grande échelle de produits chimiques odorantes pour ORs. Néanmoins, étant donné que les lignées de cellules cultivées d’origines non-olfactifs diffèrent des OSNs natifs, ou protéines sont conservées dans le réticulum endoplasmique et incapable de faire le trafic vers la membrane plasmique, entraînant perte de récepteur fonction18 et la dégradation de l’OR , 19. pour résoudre ce problème, importants travaux ont été faits pour répliquer l’expression fonctionnelle d’OR sur la membrane cellulaire dans les lignées cellulaires hétérologue. Krautwurst et coll. d’abord attaché les 20 premiers acides aminés de la rhodopsine (Rho-tag) à la N-terminale de la protéine de l’OR et cela favorisé l’expression de la surface cellulaire de certains ORs de cellules humaines embryonnaires de rein (HEK)20. En procédant à une analyse en série de (SAGE) Bibliothèque analyse l’expression génique de OSNs unique, Saito et al. tout d’abord cloné transportant des récepteurs protéiques (RTP) membres de la famille, RTP1 et RTP2 et la protéine réceptrice de l’enrichisseur expression 1 (REEP1) qui a facilité le trafic d’OR à la membrane cellulaire et améliorés de réponses véhiculées par les odorants des RUP dans les cellules HEK293T 21. se fondant sur ces constatations, le groupe Matsunami réussi à établir la lignée de cellules Hana3A, stablement transfected avec RTP1, RTP2, REEP1 et Gαolf dans HEK293T et transitoirement transfectées avec ORs Rho-tag, efficaces ou fonctionnels expression. Les études ont révélé 1) une forme plus courte de RTP1, RTP1S, qui pourrait plus fermement favorisent ou fonction que la protéine originale de RTP1 et 2) le récepteur muscarinique de l’acétylcholine, type 3 (M3R) qui pourrait augmenter l’activité d’OR par l’intermédiaire de l’inhibition de la β-arrestine-2 recrutement, qui ont été introduits dans le système d’expression hétérologue pour optimiser expérimental sortie22,23.
Plusieurs méthodes de détection ont été utilisés pour quantifier l’activation des récepteurs dans les systèmes hétérologues. Le dosage de la phosphatase alcaline placentaire sécrétées (SEAP) travaille avec une enzyme de journaliste transcriptionnellement réglementée par des éléments de réponse de l’AMPc (CREs), ce qui en fait une option intéressante pour évaluer l’activation de l’OR. La fluorescence est facilement détectée dans un échantillon de milieu de culture après l’incubation avec SEAP détection réactif24. En utilisant cette méthode, les fonctions d’ORs comme une classe secondaire des récepteurs chemosensoriels exprimée dans la trace de OE-les récepteurs associés à amine (TAARs) ont été caractérisent25,26,27. Une autre méthode courante, le dosage de la luciférase, utilise un gène rapporteur luciférase de firefly sous le contrôle de l’élément de réponse de l’AMPc (CRE). Luminescence générée par la production de la luciférase procure un moyen efficace et robuste de quantifier OR activation10,11,28.
Des tests en temps réel de cAMP aussi sont sont répandues dans la surveillance dynamiquement la fonction des RCPG hétérologues ou endogènes. Un exemple de ces tests avancés tire parti d’une variante de biocapteur génétiquement codé, qui possède un domaine de liaison au cAMP fusionné à une forme mutante de la luciférase. Lorsque le cAMP se lie, le changement conformationnel aboutit à l’activation de la luciférase, luminescence d’où peut ensuite être mesurée avec un lecteur de chimiluminescence29,30. La technologie en temps réel de cAMP a été signalée pour l’orphelin hors des récepteurs de l’odeur humaine dans les cellules HEK293 et NxG de 108CC15âne = « xref » > 31,32,33, ainsi que dans le Hana3A dérivé de HEK293T cellules34,35. Le groupe Krautwurst a également décrit en détail la technologie cAMP en temps réel afin de convenir aux bi-directionnel à grande échelle ou la projection des approches32,33.
Nous décrivons ici un protocole permettant de mesurer l’activation d’OR à l’aide d’un essai en temps réel de cAMP dans les cellules Hana3A. Dans ce protocole, la luminescence des cellules vivantes préalablement équilibrés est cinétiquement mesurée pendant 30 min après le traitement par certains composés volatils, ce qui représente une analyse plus efficace et plus précise de l’activation d’OR qui sont moins sensibles aux artefacts qui se produisent dans l’environnement cellulaire avec temps prolongé et la toxicité cellulaire induite par l’odeur. Cette mesure en temps réel permet un dépistage à grande échelle des ORs et des ligands, ainsi que la caractérisation des paires d’OR-ligand spécifiques d’intérêt. En utilisant cette méthode, nous avons avec succès identifié OR5AN1 comme le récepteur de la muscone composés de musc en réalisant une projection contre 379 ORs humaines et en confirmant par la suite le résultat du dépistage positif.
Mesurer avec exactitude l’activation de l’OR après une exposition à une certaine substance odorante est la première étape en déchiffrant le codage de l’information olfactive. Les expériences montré dans cet étude représentent qu’un exemple de la façon dont on peut identifier, en utilisant un in vitro système d’expression OR, ORs sensibles parmi le répertoire OR humain pour la substance odorante d’intérêt et ensuite caractériser les récepteurs pharmacologie à l’aide de différentes co…
The authors have nothing to disclose.
Le travaux ont été subventionnés par la Chinese National Science Foundation (31070972), la Science et la technologie Commission of Shanghai Municipality (16ZR1418300), le programme novateur recherche équipe de Shanghai Municipal Education Commission, le Shanghai Eastern Scholar Program (J50201) et le Programme National de recherche fondamentale de la Chine (2012CB910401).
Amphotericin B | Sigma | A2942 | |
DMSO | Sigma | D2650 | |
FBS | Gibco | 10099-141 | |
GloSensor cAMP reagent | Promega | E1290 | |
pGloSensor-20F cAMP plasmid | Promega | E1171 | |
Hana3A cells | available from authors upon request | ||
HBSS, w/o calcium chloride and magnesium chloride | GIBCO | 14175095 | |
HEPES | Hyclone | SH30237 | |
Lipofectamine2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
M3R plasmid | cloned into a mammalian expression vector such as pCI | ||
MEM, w/EBSS and w/L-glutamine | Hyclone | SH30024 | |
Muscone | Santa Cruz | sc-200528 | |
Musk tibetene | Sigma-Aldrich | S359165 | |
OR plasmids | cloned with a Rho-tag into a mammalian expression vector such as pCI | ||
PBS, w/o calcium or magnesium | Cellgro | 21-040-CV | |
Penicillin-streptomycin | Hyclone | SV30010 | |
Plasmid miniprep kit | Tiangen | DP103-03 | |
Puromycin | Sigma | P8833 | |
RTP1S plasmid | cloned into a mammalian expression vector such as pCI | ||
Trypsin-EDTA | Hyclone | SH30236 | |
0.2-mL PCR tube | Axygen | PCR-02-C | |
1.5-mL Eppendorf tube | Eppendorf | ||
15-mL 17 mm x 120 mm conical tube | BD Falcon | 352096 | |
8-well and/or 12-well multichannel pipetman | Eppendorf | ||
96-well flat-bottomed white cell culture plate | Greiner | 655098 | |
100 mm x 20 mm cell culture dish | BD Falcon | 353003 | |
Class II biological safety cabinet with laminar flow | |||
Cell culture incubator, w/ 5% CO2 | |||
Centrifuge, with swinging bucket rotor for 15-ml conical tubes | |||
Infinite F200 plate reader | Tecan | ||
Phase-contrast microscope with x10 and x20 objectives | |||
Spectrophotometer | |||
Sterile reagent reservoirs for multichannel distribution | |||
Sterile paper towel |