Préparation à moyen terme de<em> Drosophila</em> Extraits d'embryons pour les expériences protéomiques
Summary
Le but de ce protocole est de fournir une approche simple et peu coûteuse pour collecter des embryons de Drosophila à l'échelle moyenne (0,5-1 g) et préparer des extraits de protéines qui peuvent être utilisés dans des applications protéomiques en aval, telles que la purification par affinité, la spectrométrie de masse (AP-MS ).
Abstract
L'analyse des interactions protéines-protéines (IPP) est devenue une approche indispensable pour étudier les processus et mécanismes biologiques, tels que la signalisation cellulaire, le développement de l'organisme et la maladie. Il est souvent souhaitable d'obtenir des informations PPI en utilisant du matériel in vivo , afin d'obtenir la vision la plus naturelle et la plus imparfaite des réseaux d'interaction. La mouche des fruits Drosophila melanogaster est une excellente plate-forme pour étudier les IPP in vivo et se prête à des approches directes pour isoler le matériel pour les expériences biochimiques. En particulier, les embryons de mouche des fruits représentent un type de tissu approprié pour étudier les PPI, en raison de la facilité de collecte des animaux à cette étape de développement et du fait que la majorité des protéines sont exprimées dans l'embryogenèse, fournissant ainsi un environnement pertinent pour révéler la plupart des IPP. Nous présentons ici un protocole pour la collecte d'embryons de Drosophila à l'échelle moyenne (0,5 à 1 g), ce qui constitue un montant idéal pour une large gamme deApplications protéomiques, y compris l'analyse des IPP par spectrométrie de masse par purification par affinité (AP-MS). Nous décrivons nos modèles pour les cages 1 L et 5 L pour les collections d'embryons qui peuvent être facilement et peu coûteuses dans n'importe quel laboratoire. Nous proposons également un protocole général pour la collecte des embryons et l'extraction des protéines pour générer des lysats qui peuvent être utilisés directement dans les applications en aval telles que l'AP-MS. Notre objectif est de fournir un moyen accessible à tous les chercheurs d'effectuer les analyses des IPP in vivo .
Introduction
Les écrans génétiques et, plus récemment, les approches génomiques ont révolutionné l'étude des fonctions biologiques. Cependant, des informations cellulaires importantes sont codées dans les protéines et leur ensemble de partenaires en interaction. Alors que les écrans modificateurs génétiques traditionnels peuvent identifier les composants de la voie limitant le taux et récupérer les interactions indirectes, la force des approches protéomiques réside dans leur capacité à identifier des réseaux complets d'interactions immédiates de protéines d'intérêt. La protéomique est donc une méthode orthogonale précieuse pour étudier les systèmes biologiques et complète la génomique, la transcriptomie et les écrans génétiques traditionnels. La purification par affinité – la spectrométrie de masse (AP-MS) s'est révélée être une approche puissante pour étudier les interactions protéines-protéines (IPP) dans leur milieu naturel dans les cellules et les tissus 1 , 2 . Cette méthode permet d'identifier des interactions directes ou indirectes à un développement spécifiqueDes étapes ou des contextes tissulaires, et a été utilisée avec succès pour identifier de multiples IPP nouveaux dans une variété de voies de développement (examinées dans la référence 1 ). Malgré le succès incontesté des études PPI, la plupart d'entre elles ont été réalisées dans des cellules cultivées, dans lesquelles les protéines d'intérêt "appât" ont été surexprimées. Il existe deux problèmes avec l'étude des PPI dans la culture cellulaire: premièrement, une lignée cellulaire spécifique peut ne pas fournir un complément complet d'interactions en raison du manque d'expression de certaines protéines. Deuxièmement, une forte surexpression habituellement utilisée dans de telles analyses pourrait conduire à des artefacts tels que le repli des protéines ou l'identification d'interactions faussement positives.
Ces deux limites peuvent être surmontées en analysant les IPP in vivo . Une étape limitante dans de telles expériences est la disponibilité du matériau de départ pour la purification des complexes de protéines. Drosophila melanogaster a longtemps été utilisé comme modèle d'analyse fonctionnelleSis, et récemment, il a également été démontré qu'il s'agissait d'un excellent système d'étude des IPP in vivo . L'embryogenèse de Drosophila représente un type de tissu particulièrement attrayant pour étudier les IPP, car les embryons peuvent être facilement collectés en grandes quantités, et aussi parce que la plupart des gènes (> 88%) sont exprimés au cours de l'embryogenèse, fournissant ainsi un environnement riche in vivo pour détecter des facteurs pertinents PPI 3 .
Traditionnellement, les études biochimiques dans les mouches utilisaient des collections embryonnaires à très grande échelle (100-150 g), telles que celles nécessaires à la purification des lysats fonctionnels transcriptionnels 4 , 5 . Les études AP-MS antérieures chez Drosophila nécessitaient également de grandes quantités d'embryons (5-10 g), car elles reposaient sur une approche de purification en deux étapes telle que la purification par affinité en tandem (TAP), avec la perte de matériau associée à chaque étape 6 . Grand amounLe matériel de départ nécessitait la mise en place de collections d'embryons dans de grandes cages de population, ce qui peut coûter cher (lorsqu'ils sont achetés sur le marché) et long-temps pour maintenir et nettoyer 7 , 8 , 9 .
Les progrès récents dans le développement des approches de purification d'affinité à une étape, ainsi que la sensibilité croissante des spectromètres de masse, ont réduit la quantité nécessaire de matériau de départ d'un ordre de grandeur. En utilisant des marqueurs tels que le peptide de liaison à la streptavidine (SBP) ou la protéine fluorescente verte (GFP) et à partir de moins de 1 g d'embryons, il est possible d'isoler les quantités de protéines d'appât et les composants interactifs qui seraient suffisants pour l'identification par Spectrométrie de masse 10 , 11 .
L'objectif du protocole présenté ici est d'aider les chercheurs à surchargerMoi, une barrière perçue à l'analyse biochimique des IPP in vivo . À cette fin, nous proposons une procédure simple et peu coûteuse pour collecter des embryons de Drosophila à l'échelle moyenne (0,5 à 1 g), suivie d'une préparation en une étape d'extraits de protéines de cellules entières qui conviennent pour une analyse ultérieure par AP-MS ou d'autres approches . Notre méthode repose sur l'utilisation de cages de population sur mesure de 1-L ou 5-L qui peuvent être facilement produites par n'importe quel laboratoire. En outre, les conditions d'extraction présentées ici ont été validées dans plusieurs études, à la fois dans des cellules cultivées et in vivo 10 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 .
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole présenté ici est une procédure simple et générale pour la mise en place des cages de population de Drosophila à l'échelle moyenne et la production d' extraits de protéines à cellules entières à partir d'embryons. Les extraits résultants peuvent être utilisés dans une variété d'applications en aval, telles que la purification de complexes de protéines sur des résines d'affinité. Il est essentiel d'effectuer les étapes d'extraction sur la glace…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient les membres du laboratoire de Veraksa pour des commentaires utiles sur le manuscrit et des suggestions pour l'amélioration des protocoles. AV a été soutenu par les subventions NIH GM105813 et NS096402. LY a été soutenu par la bourse de doctorat de Boston Sanofi Genzyme de l'Université du Massachusetts.
Materials
| Leaktite 5-Qt. Natural Multi Mix Container (Pack of 3) | Home Depot | 209330 | For making 5-L cages. |
| Leaktite 5-Qt. Natural Multi Mix Lid (Pack of 3) | Home Depot | 209320 | Diameter 8.37 in. Lids for 5-L cages. |
| Fisherbrand Petri dishes with clear lid, 100 x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875712 | Material: Polystyrene. To be used with 1-L cages. |
| Fisherbrand Petri dishes with clear lid, 150 x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875714 | Material: Polystyrene. To be used with 5-L cages. |
| Fisherbrand Petri dishes with clear lid, 60 x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875713A | Material: Polystyrene. Used during embryo dechorionation. |
| Sefar NITEX nylon mesh | Sefar | 03-180/44 | 180 micron, 44% open area, used for fly cages. |
| Milwaukee 3 in. Hole Dozer Hole Saw with Arbor | Home Depot | 49-56-9670 | 3 inch cutting tool for making 1-L cages. |
| Nalgene Wide-Mouth Straight-Sided PMP Jars with White Polypropylene Screw Closure | Fisher Scientific | 11-823-33 | For making 1-L cages. Thermo Scientific cat # 21171000. Alternative 1-L containers can be used. |
| Red Star Active Dry Yeast, 2 pound pouch | Red Star | can be purchased from Amazon.com or other suppliers. | |
| Frozen 100% Apple Juice Concentrate | can be purchased from a grocery store. Has to say "100% apple juice" on the can. | ||
| Methyl 4-hydroxybenzoate | Acros Organics | AC126965000 | also known as methylparaben or Tegosept. Used as a preservative in AJ plates. |
| IGEPAL CA-630 for molecular biology, 100 ml | Sigma | I8896 | used for preparing lysis buffer. |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with CN Membrane | Fisher Scientific | 09-740-2A | 0.2 μm pore size. Used for filtering 5x lysis buffer. Thermo Scientific cat # 1260020. |
| CO-RO ROCHE cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | 11697498001 | Vial of 20 tablets. Used for protease inhibition in lysis buffer. |
| Corning SFCA syringe filters | Fisher Scientific | 09-754-21 | SFCA membrane, diameter 26 mm, pore size 0.45 μm. Used for filtering final extract samples. |
| BD Luer-Lok Disposable Syringes without Needles | Fisher Scientific | 14-823-2A | for filtering final extract samples. BD cat # 309604. |
| Bleach | Clorox | used for embryo dechorionation at 50% (vol/vol) in water, can be purchased at any supermarket. It is important to use the Clorox brand, as other brands may result in incomplete dechorionation or may be toxic for embryos. | |
| Corning Costar Netwell Plates | Fisher Scientific | 07-200-213 | mesh containers for embryo collections. 74 μm mesh size, 6-well. |
| Wheaton Dounce Tissue Grinders, capacity 15 ml | Fisher Scientific | 06-435B | homogenizer for embryos, with loose and tight pestles. Wheaton cat # 357544. |
Referencias
- Veraksa, A. Regulation of developmental processes: insights from mass spectrometry-based proteomics. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 723-734 (2013).
- Gavin, A. C., Maeda, K., Kuhner, S. Recent advances in charting protein-protein interaction: mass spectrometry-based approaches. Curr Opin Biotechnol. 22 (1), 42-49 (2011).
- Arbeitman, M. N., et al. Gene expression during the life cycle of Drosophila melanogaster. Science. 297 (5590), 2270-2275 (2002).
- Soeller, W. C., Poole, S. J., Kornberg, T. In vitro transcription of the Drosophila engrailed gene. Genes Dev. 2 (1), 68-81 (1988).
- Kamakaka, R. T., Kadonaga, J. T. The soluble nuclear fraction, a highly efficient transcription extract from Drosophila embryos. Methods Cell Biol. 44, 225-235 (1994).
- Kyriakakis, P., Tipping, M., Abed, L., Veraksa, A. Tandem affinity purification in Drosophila: The advantages of the GS-TAP system. Fly (Austin). 2 (4), 229-235 (2008).
- Shaffer, C. D., Wuller, J. M., Elgin, S. C. Raising large quantities of Drosophila for biochemical experiments. Methods Cell Biol. 44, 99-108 (1994).
- Sisson, J. C. Culturing large populations of Drosophila for protein biochemistry. CSH Protoc. 2007, (2007).
- Caravaca, J. M., Lei, E. P. Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage. J Vis Exp. (109), (2016).
- Yang, L., et al. Minibrain and Wings apart control organ growth and tissue patterning through down-regulation of Capicua. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (38), 10583-10588 (2016).
- Neumuller, R. A., et al. Stringent analysis of gene function and protein-protein interactions using fluorescently tagged genes. Genética. 190 (3), 931-940 (2012).
- Veraksa, A., Bauer, A., Artavanis-Tsakonas, S. Analyzing protein complexes in Drosophila with tandem affinity purification-mass spectrometry. Dev Dyn. 232 (3), 827-834 (2005).
- Mukherjee, A., et al. Regulation of Notch signalling by non-visual beta-arrestin. Nat Cell Biol. 7 (12), 1191-1201 (2005).
- Gilbert, M. M., Tipping, M., Veraksa, A., Moberg, K. H. A Screen for Conditional Growth Suppressor Genes Identifies the Drosophila Homolog of HD-PTP as a Regulator of the Oncoprotein Yorkie. Dev Cell. 20 (5), 700-712 (2011).
- Anjum, S. G., et al. Regulation of Toll Signaling and Inflammation by beta-Arrestin and the SUMO Protease Ulp1. Genética. 195 (4), 1307-1317 (2013).
- Degoutin, J. L., et al. Riquiqui and minibrain are regulators of the hippo pathway downstream of Dachsous. Nat Cell Biol. 15 (10), 1176-1185 (2013).
- Zhang, C., et al. The ecdysone receptor coactivator Taiman links Yorkie to transcriptional control of germline stem cell factors in somatic tissue. Dev Cell. 34 (2), 168-180 (2015).
- Lemmon, M. A., Schlessinger, J. Cell signaling by receptor tyrosine kinases. Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).
- Vincent, J. P., Girdham, C. H., O’Farrell, P. H. A cell-autonomous, ubiquitous marker for the analysis of Drosophila genetic mosaics. Dev Biol. 164 (1), 328-331 (1994).
- Zhai, B., Villen, J., Beausoleil, S. A., Mintseris, J., Gygi, S. P. Phosphoproteome analysis of Drosophila melanogaster embryos. J Proteome Res. 7 (4), 1675-1682 (2008).
- Franco, M., Seyfried, N. T., Brand, A. H., Peng, J., Mayor, U. A novel strategy to isolate ubiquitin conjugates reveals wide role for ubiquitination during neural development. Mol Cell Proteomics. 10 (5), (2011).
- Ramirez, J., et al. Proteomic Analysis of the Ubiquitin Landscape in the Drosophila Embryonic Nervous System and the Adult Photoreceptor Cells. PLoS One. 10 (10), 0139083 (2015).
