中等规模的制备<em>果蝇</em>蛋白质组学实验胚胎提取物
Summary
该方案的目标是提供一种直接和廉价的方法来收集中等规模的果蝇胚胎（0.5-1 g），并制备可用于下游蛋白质组学应用的蛋白质提取物，如亲和纯化 – 质谱（AP-MS ）。
Abstract
蛋白质 – 蛋白质相互作用（PPI）的分析已经成为研究生物过程和机制，如细胞信号传导，生物发育和疾病的不可或缺的方法。通常希望使用体内材料获得PPI信息，以获得最自然和无偏见的互动网络视图。果蝇果蝇黑腹果蝇是体内研究PPIs的绝佳平台，适用于生物化学实验隔离材料的简单方法。特别地，由于在该发育阶段易于收集动物以及大多数蛋白质在胚胎发生中表达，所以果蝇胚代表研究PPI的便利类型的组织，从而提供了显示大多数PPI的相关环境。在这里，我们提出了中等规模收集果蝇胚胎的方案（0.5-1 g），这是一个广泛的蛋白质组学应用，包括通过亲和纯化 – 质谱（AP-MS）分析PPI。我们描述我们的设计为1 L和5 L网箱的胚胎收集，可以轻松，廉价地设置在任何实验室。我们还提供用于胚胎收集和蛋白质提取的通用方案，以产生可直接用于下游应用如AP-MS的裂解物。我们的目标是为所有研究人员提供一种可行的手段来进行体内 PPI的分析。
Introduction
遗传筛选和最近的基因组方法已经彻底改变了生物功能的研究。然而，重要的细胞信息被编码在蛋白质及其相互作用的合作伙伴的整体中。虽然传统的基因修饰屏可以识别速率限制途径成分并恢复间接相互作用，但蛋白质组学方法的强度在于它们识别感兴趣的蛋白质的完全即时相互作用网络的能力。因此，蛋白质组学是研究生物系统的有价值的正交方法，补充基因组学，转录组学和传统遗传筛选。亲和纯化 – 质谱（AP-MS）已被证明是研究细胞和组织中天然环境中蛋白质 – 蛋白质相互作用（PPI）的有力方法。这种方法允许在特定发展中识别直接或间接的相互作用已经成功地用于鉴定多种发育途径中的多种新型PPI（参考文献1 ）。尽管PPI研究取得了无可争议的成功，但其大部分已经在培养的细胞中进行，其中感兴趣的“诱饵”蛋白质被过度表达。在细胞培养中研究PPI有两个问题：首先，特定的细胞系由于缺乏某些蛋白质的表达而不能提供完整的相互作用。第二，通常在这种分析中使用的高过表达可能导致人为的物质，如蛋白质错误折叠或假阳性相互作用的识别。
这两个限制都可以通过在体内分析PPI来克服。这种实验中的限制性步骤是可用于纯化蛋白质复合物的原料。 黑腹果蝇长期以来一直被用作功能分析的模型sis，最近也被证明是在体内研究PPIs的优秀体系。 果蝇胚胎发生是研究PPI的特别有吸引力的组织类型，因为可以容易地收集胚胎，并且也因为大多数基因（> 88％）在胚胎发生过程中被表达，因此提供了丰富的体内环境来检测相关的PPIs 3 。
传统上，苍蝇的生物化学研究利用非常大规模的胚胎收集（100-150 g），如纯化功能转录裂解物4,5所必需的。以前在果蝇中的 AP-MS研究也需要大量的胚胎（ 5-10g ），因为它们依赖于两步纯化方法，例如串联亲和纯化（TAP），每个步骤6都有相关的材料损失。大型的起始材料需要在大型人口笼中设置胚胎收集，这可能是昂贵的（在商业购买时）并且耗时地维持和清洁7,8,9 。
单步亲和纯化方法的发展的最新进展以及质谱仪的增加的灵敏度已将原料的必要量减少一个数量级。使用诸如链霉抗生物素蛋白结合肽（SBP）或绿色荧光蛋白（GFP）的标签并从小于1g的胚胎开始，可以分离足以鉴定的诱饵蛋白质和相互作用成分的量质谱法10,11 。
这里提出的协议的目标是帮助研究人员我感受到体内 PPI 的生物化学分析的障碍。为此，我们提供了一种简单而廉价的方法来收集中等规模（0.5-1 g）的果蝇胚胎，然后一步制备适合随后通过AP-MS或其他方法分析的全细胞蛋白质提取物。我们的方法依赖于使用可由任何实验室轻松生产的定制的1-L或5-L种群笼。此外，这里提出的提取条件已经在几个研究中验证，在培养的细胞中和在体内 10,12,13,14,15,16,17。
Protocol
Representative Results
Discussion
这里提出的方案是一个简单和一般的程序，用于在中等规模设置果蝇种群笼子，并从胚胎中制备全细胞蛋白质提取物。所得提取物可用于各种下游应用，例如在亲和树脂上纯化蛋白质复合物。在冰上进行提取步骤和使用强烈的蛋白酶抑制是至关重要的，以最小化蛋白质降解。如所述，该方案适用于分离大多数细胞质和一些膜和可溶性核蛋白6,10,12,15。它可以容易地适应于来自其他隔室的更集…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者感谢Veraksa实验室的成员对手稿的帮助意见和协议改进建议。 AV由NIH授权GM105813和NS096402支持。 LY得到马萨诸塞州大学波士顿赛诺菲药学博士学位的支持。
Materials
| Leaktite 5-Qt. Natural Multi Mix Container (Pack of 3) | Home Depot | 209330 | For making 5-L cages. |
| Leaktite 5-Qt. Natural Multi Mix Lid (Pack of 3) | Home Depot | 209320 | Diameter 8.37 in. Lids for 5-L cages. |
| Fisherbrand Petri dishes with clear lid, 100 x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875712 | Material: Polystyrene. To be used with 1-L cages. |
| Fisherbrand Petri dishes with clear lid, 150 x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875714 | Material: Polystyrene. To be used with 5-L cages. |
| Fisherbrand Petri dishes with clear lid, 60 x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875713A | Material: Polystyrene. Used during embryo dechorionation. |
| Sefar NITEX nylon mesh | Sefar | 03-180/44 | 180 micron, 44% open area, used for fly cages. |
| Milwaukee 3 in. Hole Dozer Hole Saw with Arbor | Home Depot | 49-56-9670 | 3 inch cutting tool for making 1-L cages. |
| Nalgene Wide-Mouth Straight-Sided PMP Jars with White Polypropylene Screw Closure | Fisher Scientific | 11-823-33 | For making 1-L cages. Thermo Scientific cat # 21171000. Alternative 1-L containers can be used. |
| Red Star Active Dry Yeast, 2 pound pouch | Red Star | can be purchased from Amazon.com or other suppliers. | |
| Frozen 100% Apple Juice Concentrate | can be purchased from a grocery store. Has to say "100% apple juice" on the can. | ||
| Methyl 4-hydroxybenzoate | Acros Organics | AC126965000 | also known as methylparaben or Tegosept. Used as a preservative in AJ plates. |
| IGEPAL CA-630 for molecular biology, 100 ml | Sigma | I8896 | used for preparing lysis buffer. |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with CN Membrane | Fisher Scientific | 09-740-2A | 0.2 μm pore size. Used for filtering 5x lysis buffer. Thermo Scientific cat # 1260020. |
| CO-RO ROCHE cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | 11697498001 | Vial of 20 tablets. Used for protease inhibition in lysis buffer. |
| Corning SFCA syringe filters | Fisher Scientific | 09-754-21 | SFCA membrane, diameter 26 mm, pore size 0.45 μm. Used for filtering final extract samples. |
| BD Luer-Lok Disposable Syringes without Needles | Fisher Scientific | 14-823-2A | for filtering final extract samples. BD cat # 309604. |
| Bleach | Clorox | used for embryo dechorionation at 50% (vol/vol) in water, can be purchased at any supermarket. It is important to use the Clorox brand, as other brands may result in incomplete dechorionation or may be toxic for embryos. | |
| Corning Costar Netwell Plates | Fisher Scientific | 07-200-213 | mesh containers for embryo collections. 74 μm mesh size, 6-well. |
| Wheaton Dounce Tissue Grinders, capacity 15 ml | Fisher Scientific | 06-435B | homogenizer for embryos, with loose and tight pestles. Wheaton cat # 357544. |
Referencias
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