Olgun Schwann Hücrelerinin Üretimi İçin Bir Kaynak Olarak Kemik İçi Türe Göre Progenitör Hücrelerin Hipoksik Ön Koşullandırma
Summary
Sinirsel potansiyeli olan ilik stromal hücreleri (MSC'ler) kemik iliğinde mevcuttur. Protokolümüz hipoksik ön koşullandırma yoluyla bu hücre popülasyonunu zenginleştirir ve bundan sonra onları olgun Schwann hücreleri haline getirir.
Abstract
Bu el yazması, kemik iliği stromal hücresi (MSC) popülasyonundan nöral progenitörler için zenginleştirmek ve bundan sonra olgun Schwann hücre kaderini yönlendirmek için bir araç tanımlamaktadır. Sıçan ve insan MSC'leri, epidermal büyüme faktörü (EGF) / bazik fibroblast büyüme faktörü (bFGF) takviyesi ile düşük bağlanma alt tabakasında nörosferler olarak genişleyen, ardından geçici hipoksik koşullara (1 saat boyunca% 1 oksijen) tabi tutuldu. Neurospheres, poli-D-lizin / laminin kaplı doku kültürü plastik üzerine ekildi ve Schwann hücresi benzeri hücreleri (SCLC'ler) üretmek için β-Heregulin, bFGF ve trombosit türevli büyüme faktörü (PDGF) içeren bir gliojenik kokteylde kültürlendi. SCLC'ler, E14-15 gebe Sprague Dawley sıçanlarından elde edilen saflaştırılmış dorsal kök gangliyon (DRG) nöronları ile 2 hafta boyunca kokültür yoluyla kader taahhüdüne yönlendirildi. Olgun Schwann hücreleri S100β / p75 ekspresyonunda kalıcılık sergiler ve miyelin segmentleri oluşturabilir. Bu şekilde üretilen hücrelerin potansiyelleriOmurilik hasarını takiben otolog hücre transplantasyonunda ve hastalığın modellemesinde uygulanmalar.
Introduction
Sinir öncüleri ve türevlerinin transplantasyonu, travmatik sinir yaralanması 1 , 2 ve nörodejenerasyon 3 , 4'ü takiben bir tedavi stratejisi olarak vaat ettiğini göstermektedir. Klinik uygulamadan önce aşağıdakileri sağlamak önemlidir: i) otolog bir kök / progenitör hücresi kaynağına erişmek ve genişletmek için bir yöntem ve ii) bunları ilgili, olgun hücre tiplerine yönlendiren bir araç 3 . Omurilik yaralanması için hücre tedavisine olan ilgimiz yetişkin dokulardan nöral progenitörlerin sağlam, otolog bir hücre kaynağı aramamıza neden oldu.
MSC'lerin bir alt popülasyonu nöral krestten kaynaklanır ve kemik iliğinden kolaylıkla erişilebilir durumdadır. Bu hücreler nöronlar ve glia üretebilen sinir öncüleridır 5 . Serebral iskemi hayvan modelleri, hipoksinin prol Beyinde nöral progenitörlerin çıkarımı ve multipotansı 6 . Bu, kemik iliği kaynaklı nöral progenitörlerin üzerine genişleme aracı olarak hipoksik ön koşullanmayı kullanma temelini oluşturdu.
Yaralı omuriliğe Schwann hücrelerinin transplantasyonu rejenerasyon 2'yi teşvik eder. SCLC'ler, gliogenik faktörlerle ( yani, β-Heregulin, bFGF ve PDGF-AA) destek yoluyla MSC'lerden üretilebilir, ancak fenotipik instabiliteyi gösterirler. Büyüme faktörlerinin geri çekilmesi üzerine, fibroblast benzeri bir fenotipe dönüşürler 7 . Anormal farklılaşma ve karsinogenez riski nedeniyle, hücre transplantasyonunda fenotipik instabilite istenmez. Schwann hücresi prekürsörleri, embriyonik periferik sinir 8 içindeki akson demetleri ile ilişkili olduğu için, saflaştırılmış embriyonik DRG nöronları 7 ile birlikte kültürel SCLC'lere yol açtık ,Ass = "xref"> 9. Elde edilen olgun Schwann hücreleri , in vitro 7 , 9 ve in vivo 10'da kadere bağlı ve ispat fonksiyonudur.
MSC'lerden nöral progenitörlerin zenginleştirilmesi için protokolümüz basit ve etkili olup sonraki tahliller için hücre sayısının artmasına neden olur. Kader kaynaklı Schwann hücrelerinin kokültür platformu vasıtasıyla türetilmesi, glial farklılaşmanın incelenmesine ve potansiyel klinik uygulama için stabil ve fonksiyonel Schwann hücrelerinin oluşturulmasına izin verir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hipoksik ön koşullandırma ve nörosfer kültürünü kullanarak nöral progenitörleri zenginleştirmeden önce MSC'lerin "kök salanlığını" korumak esastır. Tecrübelerimize göre, multipotent MSC'ler, uzatılmış fibroblast benzeri morfolojileri ile güvenilir şekilde tanımlanabilir. Buna karşın, belirgin sitokkelet stres lifleri ile daha yassı, dört köşeli morfoloji benimseyen MSC'ler, nöral hücre kaderlerini kolayca kabul etmemekte ve atılmaları gerekmektedir. Genel olarak,…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, teknik destek için hipoksi oda aparatı ve Bayan Alice Lui'yi sağladıkları için Dr. Nai-Sum Wong'u onaylamak istiyorlar.
Materials
| αMEM | Sigmaaldrich | M4526 | |
| DMEM/F12 | Thermofisher scientific | 12400-024 | |
| Neurobasal medium | Thermofisher scientific | 21103-049 | |
| FBS | Biosera | FB-1280/500 | |
| B27 | Thermofisher scientific | 17504-001 | |
| Epidermal growth factor (EGF) | Thermofisher scientific | PHG0313 | |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Peprotech | 100-18B/100UG | |
| Nerve growth factor (NGF) | Millipore | NC011 | |
| Platelet-derived growth factor-AA (PDGF-AA) | Peprotech | 100-13A | |
| Heregulin beta-3, EGF domain (β-Her) | Millipore | 01-201 | |
| Uridine | Sigmaaldrich | U3003 | |
| 5-Fluro-2' – deoxyuridine (FDU) | Sigmaaldrich | F0503 | |
| Poly-D-lysine (PDL) | Sigmaaldrich | P7886-1G | |
| Laminin | Thermofisher scientific | 23017015 | |
| GlutaMAX | Thermofisher scientific | 35050061 | |
| Penicillin / streptomycin (P/S) | Thermofisher Scientific | 15140-122 | |
| TrypLE Express | Thermofisher Scientific | 12604-013 | |
| 10 cm plate for adherent culture | TPP | 93100 | Used for selection of MSCs by tissue culture adherence |
| 6-well plate for adherent culture | TPP | 92006 | Used for expansion of MSCs following passaging |
| UltraLow 6-well plate for non-adherent culture | Corning | 3471 | Used for neural progenitor enrichment |
| anti-human CD90(Thy-1) | BD Biosciences | 555593 | |
| anti-human CD73 | BD Biosciences | 550256 | |
| anti-human/rat STRO-1 | R&D Systems | MAB1038 | |
| anti-human nestin | R&D Systems | MAB1259 | |
| anti-human CD45 | BD Biosciences | 555480 | |
| anti-rat CD90(Thy-1) | BD Biosciences | 554895 | |
| anti-rat CD73 | BD Biosciences | 551123 | |
| anti-rat nestin | BD Biosciences | MAB1259 | |
| anti-rat CD45 | BD Biosciences | 554875 | |
| Anti-S100β | Dako | Z031101 | |
| Anti-p75 | Millipore | MAB5386 | |
| Anti-GFAP | Sigmaaldrich | G3893 | |
| Anti-Class III-beta tubulin (Tuj-1) | Covance | MMS-435P | |
| Anti-Human nuclei | Millipore | MAB1281 | |
| Hypoxia chamber | Billups-Rothenberg | MIC-101 | |
| HEPES buffer | Sigmaaldrich | H4034-100G |
Referencias
- Wiliams, R. R., Bunge, M. B. Schwann cell transplantation: a repair strategy for spinal cord injury?. Prog Brain Res. 201, 295-312 (2012).
- Kanno, H., Pearse, D. D., Ozawa, H., Itoi, E., Bunge, M. B. Schwann cell transplantation for spinal cord injury repair: its significant therapeutic potential and prospectus. Rev Neurosci. 26 (2), 121-128 (2015).
- Lindvall, O., Kokaia, Z. Stem cells in human neurodegenerative disorders–time for clinical translation?. J Clin Invest. 120 (1), 29-40 (2010).
- Terzic, D., et al. Directed Differentiation of Oligodendrocyte Progenitor Cells From Mouse Induced Pluripotent Stem Cells. Cell Transplant. 25 (2), 411-424 (2016).
- Takashima, Y., et al. Neuroepithelial cells supply an initial transient wave of MSC differentiation. Cell. 129 (7), 1377-1388 (2007).
- Felling, R. J., et al. Neural stem/progenitor cells participate in the regenerative response to perinatal hypoxia/ischemia. J Neurosci. 26 (16), 4359-4369 (2006).
- Shea, G. K., Tsui, A. Y., Chan, Y. S., Shum, D. K. Bone marrow-derived Schwann cells achieve fate commitment–a prerequisite for remyelination therapy. Exp Neurol. 224 (2), 448-458 (2010).
- Jessen, K. R., Mirsky, R. The origin and development of glial cells in peripheral nerves. Nat Rev Neurosci. 6 (9), 671-682 (2005).
- Mung, K. L., et al. Rapid and efficient generation of neural progenitors from adult bone marrow stromal cells by hypoxic preconditioning. Stem Cell Res Ther. 7 (1), 146 (2016).
- Ao, Q., et al. The regeneration of transected sciatic nerves of adult rats using chitosan nerve conduits seeded with bone marrow stromal cell-derived Schwann cells. Biomaterials. 32 (3), 787-796 (2011).
- Tondreau, T., et al. Isolation of BM mesenchymal stem cells by plastic adhesion or negative selection: phenotype, proliferation kinetics and differentiation potential. Cytotherapy. 6 (4), 372-379 (2004).
- Baksh, D., Song, L., Tuan, R. S. Adult mesenchymal stem cells: characterization, differentiation, and application in cell and gene therapy. J Cell Mol Med. 8 (3), 301-316 (2004).
- Jirsova, K., Sodaar, P., Mandys, V., Bar, P. R. Cold jet: a method to obtain pure Schwann cell cultures without the need for cytotoxic, apoptosis-inducing drug treatment. J. Neurosci. Methods. 78 (1-2), 133-137 (1997).
