Automated Protocols for Macromolecular Crystallization at the MRC Laboratory of Molecular Biology

Fabrice Gorrec; Jan L&#246;we

doi:10.3791/55790

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Bioquímica

Automatizado de protocolos de cristalización Macromolecular en el laboratorio MRC de Biología Molecular

Published: January 24, 2018

doi:

10.3791/55790

Fabrice Gorrec¹, Jan Löwe¹

¹Laboratory of Molecular Biology,Medical Research Council

Summary

Sistemas automatizados y protocolos para la preparación rutinaria de un gran número de pantallas y nanoliter gotitas de cristalización para los experimentos de difusión de vapor se describen y discuten.

Abstract

Cuando cristales de alta calidad se obtienen que difractan los rayos x, la estructura cristalina puede ser resuelto en cerca de resolución atómica. Las condiciones para cristalizar proteínas, ADN, ARN y sus complejos sin embargo no pueden ser predicho. Empleando una amplia variedad de condiciones es una forma de aumentar la producción de cristales de difracción la calidad. Dos sistemas totalmente automatizados se han desarrollado en el MRC laboratorio de Biología Molecular (Cambridge, Inglaterra, MRC-LMB) que facilitan la proyección de cristalización contra 1.920 condiciones iniciales por la difusión del vapor en gotas nanoliter. Protocolos semi-automatizados también se han desarrollado para optimizar las condiciones cambiando las concentraciones de los reactivos, el pH, o mediante la introducción de aditivos potencialmente mejorar propiedades de los cristales resultantes. Todos los protocolos correspondientes se describen en detalle y discute brevemente. Tomados en conjunto, permiten la cristalización macromolecular conveniente y altamente eficiente en una instalación de multiusuario, mientras que a los usuarios control sobre parámetros clave de sus experimentos.

Introduction

Cristalografía de rayos x se aplica extensivamente para avanzar nuestra comprensión de los mecanismos biológicos y enfermedad a nivel atómico y posteriormente ayudar a enfoques racionales de drogas discovery¹. Para ello, purificado y concentrado (2-50 mg/mL) muestras macromoleculares de proteínas, ADN, ARN, otros ligandos y sus complejos son probadas por su propensión a formar ordenó enrejados tridimensionales a través Cristalización²^,³ ^,⁴. Cuando cristales de alta calidad se obtienen que difractan los rayos x, la estructura cristalina puede resolverse en cerca de⁵^,de resolución atómica⁶. Fundamentalmente, las condiciones para cristalizar una muestra novedosa no pueden ser predichas y la producción de cristales de alta calidad es generalmente muy baja. Una razón subyacente es que muchas muestras de interés tienen propiedades bioquímicas desafiantes, que los hacen inestables en el plazo correspondiente para la cristalización (por lo general unos pocos días). Finalmente, el proceso se complica por el tiempo necesario para producir las muestras y las variantes de la muestra y para optimizar su purificación y cristalización de⁷^,⁸.

Una condición de la cristalización es una solución con un precipitado que reduce la solubilidad de la muestra y las condiciones a menudo también contienen los amortiguadores y los aditivos. Cientos de estos reactivos se adaptan bien para modificar los parámetros de los experimentos de cristalización ya que tienen baja propensión a interferir con la integridad de la muestra (como proteínas o ácidos nucleicos despliega). Mientras que prueba millones de combinaciones de reactivos de cristalización no es factible, prueba varios a muchos kits de detección – formulados con diferentes estrategias⁹^,¹⁰ – es posible con ensayos miniaturizados y protocolos automatizados. En esta perspectiva, la técnica más favorable es probablemente la difusión de vapor con 100-200 gotas de nL sentado en un pozo pequeño encima de un depósito que contiene la condición de la cristalización (25-250 μL), implementada en cristalización especializada placas¹¹ ^, ¹². la proteína muestra y condición son a menudo combinados en una proporción de 1:1 para un volumen total de 200 nL al configurar las gotitas en los pozos de la parte superior. Cristalización de proteínas nanoliter robótica puede implementarse con técnicas alternativas y las placas de la fase cúbica lipídica¹⁴ (el último de ellos se aplica específicamente a las proteínas de membrana trans-que son como el debajo-aceite lote¹³ muy poco solubles en agua).

La facilidad de cristalización en el MRC-LMB se inició en la década de 2000 y se presentó un resumen temprano de nuestros protocolos automatizados en 2005¹⁵. Se presentó una introducción histórica a la cristalización de proteínas y también un resumen de las ventajas de la robótica nanoliter acercarse (entonces un nuevo enfoque a la experimentación de rutina). Desde cristalización macromolecular es esencialmente un proceso estocástico con muy poca o ninguna previa información, empleando una amplia variedad de condiciones iniciales (convenientes) aumentar el rendimiento de calidad difracción cristales¹⁶. Además, una ventaja a menudo pasado por alto de una gran pantalla inicial es reducir significativamente la necesidad de optimización de las muestras y los cristales en muchos casos. Por supuesto, uno puede todavía necesita continuar con la optimización de algunas condiciones iniciales más adelante. Normalmente, la concentración de los reactivos y el pH entonces se investigan sistemáticamente. Más reactivos también pueden introducirse en la condición optimizada para modificar más parámetros de cristalización. Por cierto, uno debería tratar de cristalización con una muestra recién preparada, por lo tanto los protocolos correspondientes deben ser sencilla y disponible cualquier momento.

Aquí, dos totalmente automatizado sistemas diseñados en el MRC-LMB (sistemas 1 y 2) y los correspondientes protocolos describen detalladamente. La principal aplicación de estos dos sistemas es inicial por difusión de vapor en gota cristalización placas se sentaba. Sistema 1 integra un controlador de líquido, un carrusel automático para chapa, una impresora de inyección de tinta para el etiquetado de la placa y un sellador de placa adhesiva. En el sistema 1, 72 placas de 96 pocillos llenadas con kits de detección disponibles comercialmente (80 μl de condición transferida al depósito de un volumen inicial de 10 mL en tubos de ensayo), etiquetadas y selladas. Las placas se almacenan entonces en una incubadora de 10 ° C donde están disponibles para los usuarios en cualquier momento (como pantallas iniciales llamadas ‘Placas de LMB’).

Sistema 2 integra un controlador de líquido, un dispensador de nanoliter y un sellador de placa adhesiva. En el sistema 2, sentado gotas (100-1.000 nL) para experimentos de difusión de vapor se producen mediante la combinación de condiciones y la muestra en los pocillos de superior de 20 placas de 48 o 96 pocillos previamente llena de condiciones. Esto significa 1.920 condiciones de proyección inicial exitosa cuando se utilizan 20 placas LMB en el sistema 2.

Robots también se utilizan individualmente para la optimización de las condiciones, y también se describen los protocolos semi-automatizados correspondientes. El método 4-esquina¹⁷ se emplea habitualmente para producir pantallas de optimización. El protocolo correspondiente requiere primero la preparación manual de 4 soluciones (‘A, B, C y D’). Dos gradientes lineales de concentraciones (para dos agentes de la cristalización principal) entonces automáticamente se generan directamente en los depósitos de una placa de cristalización. Para esto, un manejador de líquido basado en jeringa distribuye las soluciones de 4 esquina en diferentes proporciones.

Para optimizar aún más la condición, uno puede emplear pantallas aditivos potencialmente mejorar las propiedades de los cristales resultantes¹⁸. Existen dos enfoques para tamizaje aditivo: un protocolo a partir de aditivos que distribuye en los depósitos de placas de cristalización antes de configurar las gotitas (protocolo 1) y otro protocolo donde se distribuye la pantalla añadida directamente a las gotitas (protocolo 2).

Otros desarrollos útiles que se iniciaron en el MRC-LMB para facilitar la cristalización macromolecular automatizado, también se presentan. Esencialmente, cristalización placas y dispositivos asociados como un apilable sociedad de Biomolecular de detección (SBS) tapa reduce al mínimo la evaporación de las condiciones al usar el sistema 2.

Por brevedad, se supone que los usuarios están familiarizados con las funciones básicas y mantenimiento de dispensador nanoliter, la impresora de inyección de tinta y el sellador de placa adhesiva. A menos que se indique lo contrario, se colocan las placas en la cubierta de los robots que el pocillo A1 (‘A1-esquina’) es la esquina trasera izquierda de un portador de la placa.

Protocol

1. los dos sistemas (proyección inicial) totalmente automáticos Sistema 1: preparación de placas de 96 pocillos cristalización 72 lleno de proyección kits (placas LMB) Antes de realizar el procedimiento, asegúrese de que los robots del sistema son inicializados y su software de control está abierta. Encienda el refrigerador de la compañía tubo de enfriamiento aproximadamente 30 minutos antes de iniciar el programa principal. Coloque una placa de prueba en la compañía SBS motorizada del sellador de placa. Ejecute el sellador de placa y compruebe que la película se aplica adecuadamente. Repita esta prueba dos veces más para verificar que el sellador de placa está listo. Luego, añada 20 L de agua desionizada en el contenedor principal del controlador del líquido. Desconecte los insertos de acople del recipiente pequeño (etanol del 20% solución de enjuague) y conectar los insertos en el contenedor principal. Escriba el nombre de pantalla apropiada (tabla 1) en la pantalla táctil de la impresora de inyección de tinta. A continuación, abra y cierre la puerta de carrusel para activar la rotación del carrusel. Abrir la puerta cuando se presenta la primera pila. La primera pila con 22 placas de cristalización, cada uno con la cara de la columna 1 de cargarse hacia fuera. De la misma forma de cargarse las dos pilas. Carga de las 6 placas restantes en las posiciones más altas de la pila de cuarto. A continuación, cierre la puerta del carrusel. Verificar que el display del refrigerador indica 14 ° C. Suavemente y varias veces invierten los kits de detección seleccionado durante 1 minuto. A continuación, abra el panel frontal del controlador del líquido. Abrir los tubos y colocarlos en el transportador de enfriamiento según la disposición estándar de 96 pocillos (A1, A2, etcetera). Al colocar cada tubo en el portabebé, coloque la tapa sobre una bandeja en el mismo diseño de 96 pocillos. Comprobar el tubo de posiciones y asegurar que todos los tubos de nivel y se instalaron en el portador. A continuación, cierre el panel frontal. En la ventana de ‘Inicio’ del software controlador líquido, seleccione “Ejecutar mantenimiento” y abrir el programa de lavado. Ejecute el programa para eliminar el etanol del 20% del sistema y el exterior de las puntas de dosificación de líquido de lavado. Cuando termine la descarga, haz clic en ‘Cancelar’ para volver a la ‘Startup’. Seleccione ‘Ejecutar un proceso existente’ y pulse ‘Inicio su selección. Abrir el programa ‘MRC kit distribución’. Rellene ’18’ para ‘Casos’ en la configuración de la pantalla y ejecutan el programa. Monitor del sistema están marcados los cuatro primeros platos, llenado y sellado. Una vez que todas las 72 placas han sido preparadas y colocados en el carrusel, cambiar los insertos de acople del contenedor principal para el recipiente. Ejecute el programa de ‘Puesta en marcha flush’ (ver paso 1.1.10). Apagar el refrigerador y deseche el vacío kit tubos de detección. Cuidadosamente retire las placas preparadas 72 el carrusel. Deseche el llenado incorrectamente o mal sellado de las placas. Almacenar las placas listo para su uso a 10 ° C. Sistema 2: configuración de gotas de cristalización (proteína nL 100 + 100 nL condición) de una muestra de 20 placas LMB En primer lugar, asegúrese de que robots del sistema están en el dispensador nanoliter se inicializa con el software abierto y administrador del método del controlador líquido está abierta. Gire en el transportador de enfriamiento microtubo unos 15 minutos antes de iniciar el programa principal. Coloque una placa de prueba en la compañía SBS motorizada del sellador de placa. Ejecute el sellador de placa y verificar que la placa está correctamente sellada. Pruebe el sellador de placa tres veces. A continuación, ejecute el nanoliter dispensador para nL 100 gotas de solución de la prueba en una placa de prueba. Ver bajo un microscopio que las gotas están ajustadas correctamente. Cierre el software de dispensador nanoliter y retire el bloque del sostenedor de la tira de la cubierta. A continuación, inserte en el portaplacas personalizados (ver Resultados de representante: cristalización dispositivos desarrollados en el LMB) la placa de la LMB con la mayor cantidad relativa de reactivos volátiles en sus condiciones (tabla 1). Quite la película adhesiva de la placa. Abrir el panel frontal del controlador líquido y coloque la placa no sellada en la cubierta, en la parte posterior de la primera compañía de deslizamiento (deslizamiento portadores puede sacarse para facilitar el acceso). Cubra la placa con una tapa de aluminio de la SBS. Colocar la tapa hacia la esquina posterior izquierda del portador aplicando presión suave en la esquina opuesta de la tapa. Unseal, cargar en los portadores de la correderos y cubrir las restantes 19 placas de la misma manera, trabajar de más a menos volátiles condiciones. Una vez que el portador de microtubo de enfriamiento a 4 ° C, como se indica por una luz verde, retire su tapa. Cortar la tapa de un microtubo que contiene (al menos) 440 μl de la muestra de proteína (cuadro 2). Asegúrese de que la muestra no tiene ninguna espuma sobre el menisco, como esto interferirá con el sistema de detección de líquido. Coloque el tubo en la posición 1 del portador del microtubo de enfriamiento. Coloque una placa de la polimerización en cadena en la cubierta de líquido controlador frente el portador adaptador placa móvil. A continuación, cierre el panel frontal. Después de cargar la cubierta, asegúrese de que la cubierta de dispensador nanoliter está clara del bloque del sostenedor de la tira y que los portadores en la parte posterior de las pilas de punta de 50 μl de las tapas de aluminio SBS. En la interfaz de controlador líquido ‘Método de gestión’, seleccione ‘Configuración de placas’. Controlar la inicialización de ambos sistemas y rellene los parámetros de funcionamiento. Seguir las directrices de la interfaz del método de gestión (avisos, figuras y un sistema de gestión de punta ayuda con la preparación). Comprobar que todos los necesarios componentes están listos y luego iniciar el proceso. Monitor del sistema como el dispensador de nanoliter pone las gotas en la primera placa y el sellador de placa posteriormente sella la placa. Una vez que todas las 20 placas han sido preparadas con gotitas de cristalización y volverá automáticamente a los portadores de la correderos, abrir el panel frontal y retire suavemente las placas. Compruebe que las placas estén selladas correctamente antes de almacenar para la cristalización. Limpie las tapas de la SBS con una solución de etanol al 20% antes de apilarlos en el lado izquierdo del controlador del líquido para el almacenamiento. Deseche la placa de la polimerización en cadena y microtubo. Apague el transportador enfriamiento microtubo y limpie la condensación. Deje una toalla de papel sobre la superficie del evaporador para absorber la condensación. A continuación, vuelva a colocar la cubierta del portador y cierre el panel frontal. 2. optimización de las condiciones Jeringa-manejador basado en el líquido: producir dos gradientes lineales de concentraciones en los embalses de una placa de cristalización (el método de la esquina 4). Primero, asegúrese de que el controlador de líquido en e inicializado con su software abierto. En el ‘gradiente’ tab: abrir el programa deseado, seleccione el tipo de placa de cristalización y el volumen final en los reservorios (tabla 3). La configuración avanzada para ‘máximo tiro vol’ debe ser bajada de 6.000 a 3.000 al utilizar soluciones que contengan [isopropanol] > 10% v/v y [MPD] > 20% v / v. Preparar las jeringas. Colocar un pistón en cada jeringa (extremos puntiagudos hacia abajo) e introduzca la parte posterior de las jeringas en las ranuras designadas por debajo de la cabeza del robot. La torcedura derecha para bloquearlo en posición (el programa se iniciará sólo con todas las jeringas requiere conectadas correctamente) una jeringa. Preparar los canales. Retire el marco de acero inoxidable e inserte las artesas. Las 4 posiciones a la izquierda corresponden a las 4 esquinas A, B, C, D. interruptor de lengüeta ‘SET UP’ que muestra los volúmenes de soluciones necesarias en cada jeringa (en la tabla 3, 0.5 mL de volumen muerto fue agregado a los volúmenes de muestra). Verter las soluciones de esquina en sus canales respectivos y coloque el marco en la cubierta (la estructura se mantiene en posición con 2 pequeños imanes situados en la parte delantera de la cubierta). Una forma alternativa para proceder con este paso es verter las soluciones en los canales cuando ya se colocan en la bandeja. Coloque la placa de cristalización en el transportador motorizado de la SBS. Haga clic en ‘Aspirar’ y esperar a que este paso a ser completado (cuando los pistones se detuvo en su camino). Cambie a la pestaña de ‘RUN’ y ejecutar el programa. Al finalizar el programa, volver a la ficha Configuración y haga clic en ‘Eliminar’: el sistema de purga las jeringuillas con las soluciones sobrantes de y entonces levanta los pistones completamente. ‘Purga’ puede solicitarse en lugar de ‘Eliminar’; esto dejará los pistones en la posición inferior, lista para aspirar a soluciones más con las mismas jeringas. Retire las jeringas girándolas hacia la izquierda. Deseche las jeringas y canales en el contenedor apropiado (o enjuague con agua desionizada y luego solución etanol al 20% v/v para su reutilización). Sellar la placa y coloque en el mezclador de microplacas para 3 minutos a 1.000 rpm, o 10 minutos cuando se mezclan soluciones altamente viscosas. La placa está lista para configurar gotitas de cristalización en el dispensador nanoliter. Añadido detección protocolo 1 (configuración de gotitas de cristalización en una placa de 96 pocillos cristalización precargada con pantalla aditivo) En primer lugar, preparar las condiciones con las concentraciones iniciales de los reactivos aumentadas un 10% (mínimo vol. 15 mL al transferir la condición de un contenedor en la pantalla del aditivo con el controlador de líquido). Asegúrese de que el controlador de líquido está listo para funcionar. Abrir el programa ‘Pantalla agregar aditivos’ para una sola placa (Introduzca el volumen en depósitos: ‘μl 72’). De los avisos, figuras y una punta-sistema (puntas 12 x 1.000 μl necesarias) ayuda con asegurándose de que el robot está listo para funcionar según las selecciones de. Recuperar la pantalla de la incubadora de-20 ° C y retirar inmediatamente el sello de aluminio (utilice el sostenedor de la placa), luego colocar la placa en la cubierta del controlador del líquido. El programa opera de acuerdo con un diseño de retratos (la placa se coloca con la esquina A1 ubicada en la parte delantera izquierda del portador de la). También colocar también el recipiente llenado con la condición. Ejecute el programa. Una vez que se han llenado los depósitos de la placa, colocar en el agitador de microplacas y ejecutar el programa. Enjuague el recipiente de condición con desionizada agua y 20% de etanol para su reutilización. Configurar las gotitas en el dispensador nanoliter. En primer lugar, unseal la placa de cristalización (uso el sostenedor de la placa). Entonces, lugar que tira de la placa y la proteína 8-bien en la primera posición del bloque del sostenedor de la tira. La ficha ‘Configuración’ en el software de control muestra las posiciones reales de cada componente en la cubierta. Carga cada uno de la tira con la muestra de proteína según el tamaño de la gota necesario (tabla 4). Ejecutar el programa para preparar gotas. Al finalizar el programa, retire la placa de la cubierta y sellar inmediatamente (utilizar el sellador de placas, cinta adhesiva ancha de 3 pulgadas). Deseche la tira en el recipiente adecuado. Evaluar el tamaño, forma y centrado de las gotitas al microscopio antes de guardarla. Añadido detección protocolo 2 (creación de gotitas de cristalización en una placa de 96 pocillos cristalización con una pantalla de aditiva reutilizable) En primer lugar, preparar la pantalla añadida: dejar la correspondiente placa de cultivo celular de 96 pozos congelados se descongele a temperatura ambiente durante 40 minutos. Luego, centrifugar la pantalla añadida a 1.000 x g durante 2 minutos. Preparar la condición (vol. min 15 mL al transferir la condición de un contenedor en la pantalla del aditivo con el controlador de líquido). Llenar los depósitos de una placa de 96 pocillos cristalización con la condición. En el controlador de líquido, proceder del mismo modo que el protocolo 1, paso 2.2.2, pero entrar en ’80 μl’ para el volumen en depósitos. Configurar las gotitas en el dispensador nanoliter con 3 componentes en la cubierta (la placa que contiene la pantalla añadida, junto con la placa de cristalización y la tira de proteína 8-bien en la primera posición del bloque del sostenedor de la tira, tabla 4). Sellar la placa de cultivo celular que contiene la pantalla con una hoja de aluminio y colóquelo en la incubadora de-20 ° C. Evaluar el tamaño, forma y centrado de las gotitas al microscopio antes de guardarla.

Representative Results

1. sistema 1 y placas de LMB Figura 1A muestra el sistema 1 basado en un líquido controlador de operación con un sistema de líquido (agua desionizada). El sistema de líquido compone de un recipiente, una bomba, tubos, 8 jeringas equipadas con válvulas y 8 puntas fijadas. La configuración de la clase de líquido fueron optimizada para aspirado/dispensar una amplia variedad de soluciones y multi-dispensar en placas de 4 (multi-dispensar requiere un exceso relativamente grande de volumen aspirado). Un recipiente de agua 22 L y un recipiente más pequeño (5 L) con etanol al 20% v/v se almacenan bajo el sistema a alimentar el sistema de líquido. Cada contenedor está equipado con dos insertos de acoplamiento. Uno Insertar (color azul) alimenta el sistema con líquido, el otro (rojo) es un flujo trasero para reducir el exceso de presión. Después de su uso, lavado con solución de agua y luego 20% v/v etanol previene el crecimiento microbiano. Una unidad (también se encuentra por debajo del sistema) está conectada a una compañía de refrigeración por tubo a la medida. El sistema 1 es 2050 mm de ancho, como el carrusel, 760 mm de profundidad y 88 mm de altura. Se requiere un adicional de 550 mm en el frente de la mesa de trabajo que sostiene la unidad de control de la impresora de inyección de tinta y el sellador de placa adhesiva. También es necesario espacio adicional al lado del sistema para el ordenador que los controla. El programa para producir 72 placas similares previos (es decir 18 rondas de 4 platos) toma 3 h y 50 min. Figura 1B es un primer plano de la cubierta principal que está equipado con 8 fijos extremidades (figura 1) montados sobre un brazo de pipeteo automatizado, un segundo brazo con una pinza, una estación de lavado de la punta, portadores de 2 x 4 posiciones para las placas de la SBS y la compañía tubo de enfriamiento. El programa principal procesa 4 placas a la vez que se saca automáticamente desde el carrusel y en la cubierta donde se llenan las condiciones de cristalización (80 μL en los embalses, figura 1). Automáticamente se detectan niveles de líquidos como las puntas son conductores. Mientras que el controlador líquido dispensa condiciones en un juego de placas, otro conjunto de placas vacías es sacado del carrusel, etiquetado y colocado sobre la cubierta principal. Un pequeño porta a la medida y ventana en la parte trasera del controlador líquido fueron requeridos para colocar la cabeza de la impresora y su sensor en la parte posterior de la cubierta principal. Los 8 consejos lavados y lavar con agua del envase del principal después de cada dispensación paso que consiste en 4 alícuotas en las columnas correspondientes de embalses. Después 4 placas han sido llenadas, automáticamente son sellados y colocados en su posición original en el carrusel. El sellador de placa es accionado por un controlador específico (llamado por el software de control). El sellador utiliza un rollo de 3 pulgadas de ancho cinta adhesiva que se aplica a una placa con rodillos bajo presión mecánica. Al finalizar el programa, las placas similares previos se quitan manualmente de las pilas en el carrusel y almacenadas en un incubador de 10 ° C ubicado dentro de las instalaciones. Figura 1 : Llenar los depósitos con kits de detección inicial. (A) información general sobre el sistema completamente automatizado 1. El carrusel es una unidad automatizada con pilas de la placa y se encuentra en un pozo hecho de hojas de acrílico transparente en la parte derecha de la cubierta principal. (B) la cubierta principal del controlador del líquido en operación con (a) la compañía tubo de enfriamiento (conectado a una unidad de refrigeración por debajo, no se muestra), (b) el rápido lavado estación (conectada al drenaje, no se muestra), (c) el brazo de pipeteo relleno 8 embalses de una placa de 96 pocillos de cristalización, (d) el brazo de agarre trayendo un plato lleno en (e) la compañía SBS motorizada del sellador de placa. En la parte posterior de la cubierta es (f) la impresión de la cabeza de la impresora de inyección de tinta conectada a (g) la unidad de control de inyección de tinta por debajo del sellador. (C) A etiqueta de la placa (nombre de la pantalla) y fecha de la producción está llena de condiciones de cristalización de 8 conductores fijada de puntas de acero inoxidable recubierto de politetrafluoroetileno. (D) sección transversal de una cristalización sellada bien. El depósito contiene 80 μl de condición de la cristalización (mientras que la parte superior también está vacía). Depósito y profundidad del pozo superior especificaciones está en milímetros. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. La tabla 1 muestra las diferentes formulaciones para los kits de proyección disponibles comercialmente en tubos de ensayo. Los kits se utilizan para llenar los depósitos de placas de 96 pocillos cristalización (LMB01-LMB22) de forma regular con el sistema 1. Nombre de la placa nombre del juego proveedor número de catálogo tubos Descripción básica LMB01 Pantalla de cristal 1 Investigación de Hampton HR2-110 48 Matriz escasa (pH 4.6-8.5) Pantalla de cristal 2 Investigación de Hampton HR2-112 48 Muestreo estocástico (pH 4.6 9.0) LMB02 Asistente 1 Rigaku 1009530 48 Muestreo estocástico (pH 4.5-10.5) Asistente 2 Rigaku 1009531 48 Muestreo estocástico (pH 4.5-10.5) LMB03 Sulfato de amonio de rejilla pantalla Investigación de Hampton HR2-211 24 Pantalla de la rejilla, [AmS] = 0.8-3.2 M y buffer pH 4.0-9.0 Rejilla pantalla PEG/LiCl Investigación de Hampton HR2-217 24 Pantalla de la rejilla, [PEG 6000] = 0-30 %w/v, Conc. LiCl = 1.0 M y buffer pH 4.0-9.0 Pantalla rápida Investigación de Hampton HR2-221 24 Pantalla de la rejilla, [NaKPO4] = 0.8-1.8 M a pH 5.0-8.2 Cloruro de sodio de rejilla pantalla Investigación de Hampton HR2-219 24 Pantalla de la rejilla, [NaCl] = 1.0-4.0 M y buffer pH 4.0-9.0 LMB04 Pantalla de la rejilla PEG 6000 Investigación de Hampton HR2-213 24 Pantalla de la rejilla, [PEG 6000] = 5-30 %w/v y buffer de pH 4.0-9.0 Pantalla de la rejilla MPD Investigación de Hampton HR2-215 24 Pantalla de la rejilla [MPD] = 10-65 %w/v y buffer de pH 4.0-9.0 MemFac Investigación de Hampton HR2-114 48 Matriz escasa de proteínas de membrana (pH 4.6-8.5) LMB05 PEG-Ion Investigación de Hampton HR2-126 48 Pantalla de la rejilla, [PEG 3350] = 20 %w/v y varias sales en 0,2 M (no tampones) Natrix Investigación de Hampton HR2-116 48 Factorial incompleto (pH 5.6-8.5) LMB06 Pantalla de cristal Lite Investigación de Hampton HR2-128 48 1 pantalla de cristal con la mitad de la concentración de precipitante original Pantalla personalizada de Lite Dimensiones moleculares n / a 48 Condiciones adicionales con bajas concentraciones de precipitante LMB07 Asistente Cryo 1 Rigaku 1009536 48 Muestreo estocástico con condiciones cryoprotected usando las clavijas bajo MW (pH 4.5-9.4) Asistente crio 2 Rigaku 1009537 48 Muestreo estocástico con condiciones cryoprotected usando las clavijas bajo MW (pH 4.5-10.1) LMB08 JBS1 JenaBioScience CS – 101L 24 Factorial incompleto basado en varias clavijas (pH 4.6 9.0) JBS2 JenaBioScience CS – 102L 24 Factorial incompleto basada en PEG 4000 (pH 4.6-8.5) JBS3 JenaBioScience CS – 103L 24 Factorial incompleto basada en PEG 4000 (pH 4.6-8.5) JBS4 JenaBioScience CS – 104L 24 Factorial incompleto basado en clavijas de MW medio (pH 6.5-8.5) LMB09 JBS5 JenaBioScience CS – 105L 24 Factorial incompleto basado en fuertes clavijas MW (pH 6.5-9.5) JBS6 JenaBioScience CS – 106L 24 Factorial incompleto basado en AmS (pH 4.6-8.5) JBS7 JenaBioScience CS – 107L 24 Factorial incompleto basado en MPD (pH 4.6-8.5) JBS8 JenaBioScience CS – 108L 24 Factorial incompleto basado en MPD y etanol (pH 4.6-8.5) LMB10 JBS9 JenaBioScience CS – 109L 24 Incompleta factorial basado en sales comunes y 2-propanol (pH 4.6-8.5) JBS10 JenaBioScience CS – 110L 24 Factorial incompleto basado en sales de común (pH 4.6-8.5) Clara estrategia pantalla 1 pH 4.5 Dimensiones moleculares MD1-16LMB 24 Pantalla de la rejilla con varias clavijas Clara estrategia pantalla 1 pH 5.5 Dimensiones moleculares MD1-16LMB 24 Pantalla de la rejilla con varias clavijas LMB11 Clara estrategia pantalla 1 pH 6.5 Dimensiones moleculares MD1-16LMB 24 Pantalla de la rejilla con varias clavijas Clara estrategia pantalla 1 pH 7.5 Dimensiones moleculares MD1-16LMB 24 Pantalla de la rejilla con varias clavijas Clara estrategia pantalla 1 pH 8.5 Dimensiones moleculares MD1-16LMB 24 Pantalla de la rejilla con varias clavijas Clara estrategia pantalla 2 pH 4.5 Dimensiones moleculares MD1-16LMB 24 Pantalla de la rejilla con varias clavijas LMB12 Clara estrategia pantalla 2 pH 5.5 Dimensiones moleculares MD1-16LMB 24 Pantalla de la rejilla con varias clavijas Clara estrategia pantalla 2 pH 6.5 Dimensiones moleculares MD1-16LMB 24 Pantalla de la rejilla con varias clavijas Clara estrategia pantalla 2 pH 7,5 Dimensiones moleculares MD1-16LMB 24 Pantalla de la rejilla con varias clavijas Clara estrategia pantalla 2 pH 8,5 Dimensiones moleculares MD1-16LMB 24 Pantalla de la rejilla con varias clavijas LMB13 Índice Investigación de Hampton HR2-144 96 Escasa matriz y red de pantallas pequeñas (pH 3.0-9.0) LMB14 SaltRX 1 Investigación de Hampton HR2-107 48 Sales de pantalla de la rejilla incluyendo 22 única versus concentración de sales y pH (4.1-9.0) SaltRX 2 Investigación de Hampton HR2-109 48 Sales de pantalla de la rejilla incluyendo 22 única versus concentración de sales y pH (4.1-9.0) LMB15 MemStart Dimensiones moleculares MD1-21 48 Matriz escasa de proteínas de membrana (pH 4.0-10.0) MemSys Dimensiones moleculares MD1-25 48 Pantalla de la rejilla para las proteínas de membrana (sobre todo las clavijas, pH 3.5-9.5) LMB16 JCSG + QIAGEN 130720 96 Matriz escasa (pH 4.0-10.0) LMB17 Pantalla de MORPHEUS Dimensiones moleculares MD1-46 96 Pantalla de la rejilla como mezclas de aditivos y cryoprotected condiciones (pH 6.5-8.5) LMB18 Pantalla mínimo PI JenaBioScience CS-127 96 Factorial incompleto (pH 4.0-9.5) LMB19 Pantalla de PI-PEG JenaBioScience CS-128 96 Factorial incompleto para proteínas de la membrana (pH 4.8-8.8) LMB20 Pantalla de MORPHEUS II Dimensiones moleculares MD1-91 96 Pantalla de la rejilla como mezclas de aditivos (átomos pesados) y cryoprotected condiciones (pH 6.5-8.5) LMB21 Pantalla de cristalización de LMB Dimensiones moleculares MD1-98 96 Matriz escasa incluyendo condiciones de publicaciones de la LMB LMB22 Pantalla de MORPHEUS III Dimensiones moleculares n / a 96 Pantalla de la rejilla como mezclas de aditivos (compuestos de drogas) y las condiciones cryoprotected (pH 6.5-8.5) Tabla 1: formulaciones de los kits encontradas las placas de la LMB. Cada kit de la investigación comercial consiste en 24/48/96 condiciones inicialmente en tubos de ensayo. Las placas de la LMB se estabulan en incubadoras de 10 ° C ubicados dentro de las instalaciones donde están disponibles para los usuarios en cualquier momento. 2. sistema 2 y requisitos para la creación de gotas Figura 2A muestra el sistema basado en un controlador líquido19 con desplazamiento positivo y puntas desechables 2. Puntas desechables vienen en racks apilables convenientes para el manejo automatizado. 3-posición cubierta nanoliter dispensador20 fue integrado en el lado derecho del sistema. Aspiración/dispensación en el dispensador nanoliter funciona también con desplazamiento positivo con microjeringas desechables (suministrado en carretes grandes). Como un robot autónomo, un bloque del sostenedor de la tira extraíble se utiliza para cargar muestras de proteína. Para el proceso completamente automatizado, una placa PCR 384 pocillos sustituye el titular de la tira. Un similar sellador de placa adhesiva para sistema 1 se integró en el lado izquierdo. El sellador y el nanoliter dispensador soporte en mesas de trabajo a la medida, levantados en el orden de la mordaza principal llegar a los portadores de la placa de estos dos robots integrados (una ventana tuvo que ser cortado en los paneles laterales del controlador del líquido para la muñeca para acceder fuera de la cubierta principal). El programa principal llama controladores específicos para gatillo nanoliter programas de dispensación y el sellador en su debido tiempo. El sistema 2 es 2.850 mm de ancho, 800 mm de profundidad y 800 mm de alto. Se necesita espacio adicional al lado del robot por la pantalla de la PC de control. Dos cubos de la basura se encuentran bajo el sistema de consejos y microjeringas desechados durante el proceso (el ordenador que los controla también se almacenan debajo). Una característica importante del sistema de las 2 es la disposición general, que conserva con fácil acceso a los tres robots que pueden ser utilizados individualmente para los protocolos de optimización descritos anteriormente, u otros protocolos descritos en otras partes como la cristalización de las proteínas de la membrana lipídica mesofases21 y microseed al azar matriz proyección22. Figura 2B es un primer plano de la cubierta que está equipado con un brazo robótico. El brazo integra 12 sondas pipetas independientes y la mordaza principal. Las posiciones de las sondas pueden ser controladas individualmente en una dirección para poder acceder a diferentes lugares a lo largo del eje entre las sondas o tubos incluso solos. Las sondas pueden recoger puntas desechables (1-12) o un par de movimiento de placa de adaptadores. Inicialmente se cargan dos juegos de 4 pilas con puntas desechables de 50 μl. Automáticamente se detectan niveles de líquidos como las puntas son conductores. Los adaptadores de la placa se mueve se diseñan con los 2 pernos afilados en el interior que forman a una pinza opcional cuando sea necesario. En la cubierta principal está situado un microtubo de 24 posiciones enfriamiento carrier para la muestra, aunque sólo 1-2 posiciones se utilizan aquí. Además, hay un portador de la placa de la polimerización en cadena y también 2 portadores del almacenamiento de información de tapas SBS apilable, a la medida (figura 2). Por último, hay 4 portadores del deslizamientos, con 5 posiciones para las placas de la cristalización (4 x 5 = 20 platos). Figura 2 : Configuración de gotas para los experimentos de difusión de vapor. (A) Resumen completamente automatizado del sistema de las 2. (B) la cubierta principal del controlador líquido en operación con (un) el almacenamiento de portadores para las pilas de las tapas de la SBS, (b) el apilable consejos, portador de (c) el transportador de enfriamiento con una muestra en el microtubo, (d) para el 2 de movimiento de la placa adaptadores, (e) la placa de la polimerización en cadena para transferir las placas de proteína para el robot de manipulación nanoliter, (f) 9 sellada que se han colocado en sus posiciones iniciales, (g) la pinza opcional quitar la tapa de la SBS de la 10th placa sobre para ser transportados sobre la cubierta del controlador del líquido, (h) el próximo 10 placas para estar preparados con las tapas de la SBS en la parte superior, () la garra principal que se utiliza para transportar las placas PCR y cristalización, (j) el principal automatizado brazo de integración 12 sondas pipetas (2 se utiliza para funcionar como pinza opcional) y la garra principal y (k) la cubierta del nanoliter dispensador. (C) interno tapas SBS personalizadas hecho de aluminio. Las tapas integran una hoja de goma para evitar la evaporación de las condiciones y dos pequeños agujeros para ser exactamente recogidos por la pinza opcional. (D) sección transversal de una cristalización sellada donde el depósito está lleno con una condición y el pozo superior contiene una gota compuesto de la muestra de proteína y de la condición. Debido a que el precipitado en la gota es menos concentrado que en las condiciones, las concentraciones de todos los componentes de la caída de la subida a través de la pérdida de agua durante el proceso de equilibrado por difusión de vapor (muy esquemáticamente representado por una flecha). Micrografías de luz (E) de 100 nL y (F) 200 gotas de nL producción por el dispensador nanoliter con una solución de prueba (20% v/v polietileno glicol 400, 0.001% w/v safranina como colorante rojo). El tamaño y la forma de las gotas pueden variar según chemicophysical características de la condición. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. El programa principal inicia con la pinza opcional quitar la tapa de la SBS de la primera placa de cristalización. Después de que la tapa fue transferida a la compañía de almacenamiento de información correspondientes, la placa de cristalización es transportada a la cubierta del nanoliter dispensador. Entonces el brazo de pipeteo transfiere la cantidad de muestra necesaria para configurar gotitas de microtubo normalmente frío a la primera columna de la placa de la polimerización en cadena. Posteriormente, la garra principal mueve la placa de la polimerización en cadena en la cubierta del depósito del nanoliter que preparará las gotas después de las opciones seleccionadas por el usuario en el inicio (ej. tamaño de la gota). Para ello, la muestra de proteína se distribuye primero en los pozos de alto (con un solo set de 8 microjeringas y dispensadores multi) y, a continuación, las condiciones de cristalización se suministra a las gotas de proteína (cada fila ahora requiere 8 nuevo microjeringas para evitar contaminación cruzada). Al finalizar el programa para configurar las gotitas, la garra principal transporta la correspondiente placa para el sellador de placa, a continuación, coloca la placa de la polimerización en cadena en su posición original (más proteína se distribuirá en la siguiente columna de la placa PCR para la siguiente placa ). Por último, la placa de cristalización sellado se mueve hacia atrás a su posición original en la cubierta: experimentos de difusión de Vapor ya han comenzado en esta placa (Figura 2D). Este ciclo se repite según el número de placas. Cuando sea necesario, la pinza opcional elimina un estante vacío punta permitiendo que el brazo de pipeteo acceder a más consejos. El programa toma 2 horas y 20 minutos y 440 μl de muestra para preparar gotas solo en 20 placas con muestra de nL 100 + 100 condición de nL (Figura 2E y 2F). Cuando use el despachador nanoliter como robot autónomo para dos placas adicionales (ver protocolo, paso 1.2.3), el conjunto de placas de prueba inicial en la incubadora de 10 ° C se puede configurar (22 condiciones de placas x 96 LMB = 2.112 condiciones). La tabla 2 muestra los requisitos para el programa principal según selección del usuario en el sistema 2. Placas de Tamaño de la gota (nL) Muestra (s) Requisitos de punta Duración Número Tipo Vol. 1 (μL) Vol. 2 (μL) 50 consejos de μl Microjeringas 10 96 pocillos 100 240 0 80 1040 1 h 12 min 20 96 pocillos 100 440 0 160 2080 2 h 20 min. 10 96 pocillos 100 240 240 160 2080 1 h 45 min 20 96 pocillos 100 440 440 320 4160 3 h 05 min 10 48-bien 1000 624 0 80 560 1 h 10 min 20 48-bien 1000 1208 0 160 1120 2 h 16 min Tabla 2: ejemplos de las opciones del programa principal disponibles en el sistema 2 para configurar las gotitas cristalización. La cantidad necesaria de proteína muestra, consejos y microjeringas varían según el programa. Los volúmenes de muestra ‘ vol. 1’ (1 de caída) y ‘ vol. 2’ (colocar 2) se calculan como sigue: (8 consejos x necesaria perdida de volumen por pozo de placa de PCR + 4 μL volumen) x número de placas de cristalización + 40 μl volumen muerto en microtubo. El volumen requerido por pozo de placa de la polimerización en cadena 100 gotitas de nL en placa de 96 pocillos cristalización está μl 2 μl 6.8 requiere 1.000 gotitas de nL en una placa de 48 pozos (volumen muerto en los pocillos de la placa PCR: 0,8 μL). Un volumen adicional de la muestra es tomado en consideración (‘perdido volumen’) debido a la evaporación de los microtubos y otras pérdidas (por ejemplo, muestra que se pega en consejos). Por ejemplo, para 20 platos MRC, 100 nL, 1 gota protocolo, el volumen de muestra necesario es: (8 x 2 + 4) x 20 + 40 = 440 μl (es decir, el equivalente de 22 μL por placa). Ocho puntas desechables de μl 50 se requieren para cada plato y cada muestra. Por ejemplo, para placas de 10, 2-gota de protocolo, el número de puntas requerido es de 8 x 10 x 2 = 160 consejos. El número de microjeringas se calcula como sigue: (8 + número de condiciones por placa) x número de muestras x número de placas. Por ejemplo, para placas de 10 x 48-bien, el número de consejos de líquido controlador requerido es: (8 + 48) x 1 x 10 = 560 consejos. 3. formulación, preparación y manejo de las soluciones de esquina 4 Ambas formulaciones de las soluciones de 4 esquina (‘A, B, C y D’) y la correspondiente pantalla de optimización (Figura 3A) se generan automáticamente una hoja de cálculo Excel. Hay diferentes hojas de cálculo para diferentes números de condiciones — esencialmente 24, 48 y 96 condiciones — y también hojas de cálculo para preparar dos pantallas de optimización diferentes en una sola placa. Uno normalmente prepara un conjunto de 4 x 10 mL soluciones de esquina en tubos de ensayo de que se pueden preparar 2 o 3 pantallas de optimización, dependiendo del número y volumen de las condiciones requeridas. Las soluciones se vierten en canales que son aspirados por un manejador de líquido basado en la jeringa y posteriormente distribuye directamente en las placas (figura 3B). Los dos gradientes lineales de concentraciones resultan de mezclar A, B, C y D relaciones sistemáticamente diferentes (figura 3). Figura 3: el método de la esquina 4 para la preparación de pantallas optimización. (A) representación de los dos gradientes de concentraciones a través de un diseño de placa de 96 pocillos. (B) el manejador líquido basado en jeringas listo para preparar una pantalla con 4 jeringas insertadas en la cabeza del robot. Una placa de cristalización se encuentra en el transportador motorizado de SBS y ya han salido 4 a partir de soluciones (A, B, C y D) en sus respectivos canales (las soluciones han sido sólo con fines de demostración de color rojo). (C) relaciones de las soluciones A, B, C y D a través de 96 embalses. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. La tabla 3 muestra los requisitos de los programas disponibles para los usuarios en el controlador de líquido basado en la jeringa. Tipo de placa Jajaja de las condiciones de Vol. en placa (depósitos, μL) Vol. en canal (mL) Duración 96 pocillos 48 80 1.6 2 min 5 seg 96 pocillos 96 80 2.5 3 min 50 seg 96 pocillos 2 x 48 80 1.6 2 min 50 seg 48-bien 24 200 1.8 2 min 25 seg 48-bien 48 200 3 4 min 20 seg Tabla 3: programas disponibles en el controlador líquido basado en jeringa para la preparación de pantallas de optimización según el método de la esquina 4. La placa de 96 pocillos puede usarse para preparar la pantalla de optimización 96 – 48-condición o (cuando dos pantallas de 48-condición se preparan al mismo tiempo, el robot debe estar equipado con 8 jeringas y 8 canales). Otros programas permiten el uso de placas de 48 pocillos. Los volúmenes mencionados en canales incluyen el volumen muerto requerido (0,5 mL). 4. aditivo proyección Figura 4 muestra los pasos para realizar un tamizaje aditivo a partir ya sea con 96 soluciones aditivas ya en los depósitos de la placa de cristalización (protocolo 1) o en los pozos de bajo perfil placa de cultivo utilizada como una pantalla aditivo reutilizables (de la célula Protocolo 2). La tabla 4 se enumeran los programas disponibles en el dispensador nanoliter según los dos tipos de protocolos. Figura 4: los dos tipos de protocolos de tamizaje aditivo. Las pantallas 96-aditivo se almacenan a-20 ° C. Siguiendo protocolo 1, la pantalla aditiva es agregada inicialmente a los depósitos de las placas de cristalización e idealmente almacenada de esta manera. Un controlador de líquido o una pipeta múltiple se utiliza para dispensar la condición en los reservorios que contengan soluciones aditivas (el volumen de aditivo pantalla representa el 10% del volumen final en depósitos: 8 μl de volumen final de 80 μL). Después de mezclar las condiciones de un mezclador de microplacas (no mostrado), el dispensador nanoliter microjeringa basado se utiliza para configurar las gotitas (tabla 4). Siguiendo el protocolo 2, la pantalla del aditiva es agregada solamente más adelante mientras las gotitas de cristalización. Esta vez el dispensador nanoliter se emplea para preparar las gotas con un componente adicional en su cubierta (la célula puede volver a utilizar placa de cultivo que contiene la pantalla del aditiva). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Protocolo Tamaño de la gota (nL) Tipo de la tira Vol. de muestra (μL) No. de microjeringas Duración Tipo Fuente de aditivos Proteína Condición Aditivo En cada pozo (tira) Total 1 placa de 96 pocillos cristalización 100 100 0 2 ΜL 2 16 104 2 min 1 placa de 96 pocillos cristalización 200 200 0 5 ΜL 3.8 31 104 2min 10 seg 2 placa de cultivo celular de 96 pozos 200 200 100 5 ΜL 3.8 31 200 3min 45 seg 2 placa de cultivo celular de 96 pozos 500 500 100 5 ΜL 7.4 60 200 4min 15 seg Tabla 4: programas disponibles en el dispensador nanoliter basada en la microjeringa para tamizaje aditivo. El volumen requerido de la muestra en cada pocillo de la tira de 8 pozos se calcula como sigue: volumen muerto + 12 x tamaño de la gota. Hay 2 tipos de tiras (2 μl y 5 μl). Los volúmenes muertos son 0,8 μL para los 2 pozos μl (que puede contener realmente 3,2 μl máx.) y 1,4 μL para los 5 pozos μl (7.5 μl max.). El volumen total de proteína necesaria es: 8 x volumen en el pozo de la tira (valor de round-up). El volumen muerto de los pozos en forma de V de la placa de cultivo celular de 96 pozos es 2,5 μl. El número requerido de microjeringas varía según el programa seleccionado (8 + 96 = 104; o 8 + 2 x 96 = 200). Debido a la dilución de la condición con el aditivo durante el protocolo 1, la condición debe ser preparado en una concentración proporcionalmente más alta que inicialmente. El aumento de las concentraciones finales se logra más fácilmente mediante la reducción de la adición final de agua hasta el volumen final calculado. Después de esto, uno simplemente procede con el conjunto de normal para arriba de gotas que se mezclan la condición y la muestra (p. ej., proteína de nL 100 + 100 condición nL ya mezclado con aditivos). Protocolo 2 (p. ej., proteína de nL 200 + condición de nL 200 + 100 aditivo nL) facilita la proyección a diferentes concentraciones de aditivos simplemente variando el volumen de pantalla aditivo añadido. Protocolo 2 implica más o menos dilución de las gotas (que pueden alterar la cristalización). El líquido controlador de sistema 2 se puede utilizar para aspirar suficiente condición en 12 consejos y dispensar alícuotas de 8 en los embalses de una placa de 96 pocillos (ver Protocolo, paso 2.2.2), aunque este paso se puede por supuesto hacer manualmente con una pipeta multicanal ( Figura 4). Varias placas pueden llenarse a la vez con la misma condición al utilizar el controlador de líquido (para probar diferentes pantallas añadidos más tarde). Durante la preparación de 2 placas, llene el depósito de reactivo con menos de 23 mL. Preparar 3 placas, llene el depósito de reactivo con menos de 31 mL. 5. cristalización placas y dispositivos asociados El diseño de las placas tanto MRC sesión soltar vapor difusión cristalización (96-2-gota y 48-pozo 1-gota, figura 5A y figura 5B) proporciona características que permiten experimentos de cristalización automatizado confiable y eficiente, en particular la forma esférica de los pozos de la parte superior y una ligera forma de V de los embalses que facilitan la dosificación exacta y centrifugación al centrado de las gotitas se requiere. Además, los pozos de la parte superior tienen un efecto de lente para iluminación óptima bajo un estereomicroscopio (el polímero es transmisible para la detección de cristales absorbentes de UV o fluorescentes23UV). Un sello de encargo (figura 5) permite configurar colgante gota experimentos de cristalización dentro de ambos tipos de placas mediante un dispensador nanoliter (protocolos no se muestra). Finalmente, ambas placas MRC tienen las mismas dimensiones exteriores y el borde. El borde se ajusta a las ranuras de nuestro sostenedor de la placa a la medida (figura 5), que se utiliza para manualmente colocando precinto sin salpicar líquidos. Figura 5: el MRC cristalización placas y dispositivos asociados se convirtieron en el LMB. (A) A1-esquina de la placa de 96 pocillos. El embalse (oblongo) es en el lado izquierdo del pozo de la cristalización, los dos pozos superior esféricos a la derecha. Las dimensiones están en milímetros. (B) A1-esquina de la placa de 48 pozos. El depósito está en el lado derecho del pozo (1 grande superior-bien solamente). (C) MRC sello de gota colgante. (D) placa de encargo interna titular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 6. cristales de la proteína La figura 6 muestra ejemplos de cristales útiles obtenidos con nuestros protocolos automatizados. Figura 6: micrografías de gotitas que contienen cristales obtenidos siguiendo los protocolos automáticos de luz. (A, B) Los cristales de la pantalla inicial de desaparecidas y MreB en placas preparadas con los 2 completamente los sistemas automáticos (ver Protocolo de secciones 1.1 y 1.2, condiciones: LMB07 A4 bien y LMB20 bien D12, respectivamente, tamaño de las gotas es proteína de nL 100 + 100 estado de nL, trabajo de Andrzej Szewczak, LMB)24. (C, D) Cristales de dominio de bar antes y después de la optimización de las condiciones iniciales con el método 4-esquina (paso 2.1, LMB02 B6, 1.000 nL + 1.000 nL, obra de Leonardo Almeida-Souza, LMB inédita). (E, F) Cadena pesada de dineína humano 1 cristales de dominio N-terminal antes y después de la optimización de las condiciones iniciales con el método 4-esquina (LMB20 E6, 200 nL + 200 nL, entonces 500 nL + 500 nL, obra de Edgar Morales-Ríos, LMB inédita). (G, H) Complementan cristales factor D antes y después de la optimización de la condición con proyección aditivo (paso 2.2, la condición inicial de pantalla personalizada in-House, 200 nL + 200 nL, aditivo D6 de la pantalla añadida 96-condición, obra de Matthias Bauer, inédita LMB). (I, J) Cristales de25 de glicoproteína de envoltura vírica antes y después de la optimización de la condición con proyección aditivo (paso 2.3, LMB20 A2, 150 nL + 150 nL, entonces 200 nL, 200nL + aditivo nL 100 E5 en la pantalla añadida 96-condición, inédito trabajo de Yorgo MODIS, de la Universidad de Cambridge, Reino Unido). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

1 – preparación y uso de pantallas iniciales en las placas

Kits de detección se debe mezclar antes de ser despachado en placas porque luz separación de fase o precipitación ocurre en algunos tubos durante el almacenamiento. Cuando una pantalla se compone de dos kits (tubos de 2 x 48), el primer tubo del segundo juego se coloca en E1 lugar del portador del enfriamiento. Cuando una pantalla se compone de 4 kits (4 x 24 tubos), el primer tubo del segundo juego se coloca en lugar C1, el primer tubo de la tercera equipación se coloca en la posición E1 y el primer tubo del cuarto juego se coloca en la ubicación G1. Al insertar los tubos en su portador de enfriamiento, las tapas se colocan en una bandeja siguiendo el diseño estándar de 96 pocillos de paisaje. Ya que los fabricantes indican números bien encima de las tapas, esto permite contrastar si todos los tubos han sido colocados en el orden correcto. Esto también ayuda a reemplazar las tapas correctas en los tubos cuando un número reducido de placas de relleno.

Almacenamos las placas similares previos a 10 ° C, un compromiso para evitar la congelación y almacenamiento a 4 ° C que pueden causar deterioro de las condiciones y problemas con el lacre. Las placas se almacenan durante varios meses normalmente sin notable condensación sobre la cara interior del sello. Esto es menos cierto para LMB05, LMB06, LMB09 y LMB10 placas como éstos contienen condiciones con concentraciones relativamente altas de reactivos volátiles (tabla 1). Pequeña cantidad de condensación en el lado interno de la Junta reduce la eficiencia de sellado y puede causar contaminación cruzada entre pozos al desprecintar las placas. Para ayudar con la prevención de la condensación durante el enfriamiento inicial, las placas pueden ser transferidas primero desde el carrusel en un picnic aislado refrigerador que se almacena en cuarto frío de 4 ° C durante la noche. El enfriamiento muy lento minimiza el desarrollo de gradientes de temperatura dentro de los pozos cerrados y por lo tanto, reduce la condensación total¹⁵. Además, una vez que las placas se almacenan en la incubadora de 10 ° C, una interno personalizada tapa poliestireno de SBS se coloca en la placa en la parte superior de cada pila (no mostrado).

El conjunto de nuestras placas de prellenado puede utilizarse como una gran pantalla inicial contra una muestra de proteína soluble en agua, novela. Como alternativa, menos placas pueden ser seleccionadas para que coincida con los requisitos específicos. Por ejemplo, LMB15 y LMB19 son pantallas especialmente formulados para la membrana proteína muestras²⁶^,²⁷, o LMB20 es un formulado con átomos pesados para facilitar la eliminación experimental de datos de difracción²⁸ (véase también : Formulación de las pantallas de cristalización de proteínas de Morfeo).

2. creación de gotas de cristalización

Al usar el sistema 2, proyección kits con importantes cantidades de reactivos volátiles debe ser procesado primero. Esto evita la condensación en la goma de las tapas de la SBS, que afecten el manejo de tapa y sellado de la placa. Una tapa SBS tiene un poco de espacio libre cuando en la parte superior de una placa, que por eso necesitan alinearse inicialmente (ver Protocolo, paso 1.2.6). Los volúmenes muertos de proteína en los pocillos de la placa PCR son relativamente generoso (0,8 μl, ver leyenda del cuadro 2). Tenga en cuenta que igualmente generosos volúmenes muertos se emplean cuando se usa el dispensador nanoliter individualmente con la proteína en tiras de 8 pocillos (tabla 4). Menores volúmenes muertos puede funcionar, sin embargo algunas muestras se adhieren a las puntas, calibración de un robot puede llegar a ser un poco inexacto, la sala puede ser más caliente de lo habitual, etcetera. Llevar a pérdidas de la muestra cubiertas por los generosos volúmenes muertos para consolidar el enfoque.

Novedades más permitió la miniaturización de los experimentos y por lo tanto, el volumen de muestra requerido para la detección de las condiciones de cristalización puede reducirse significativamente mediante la integración de la correspondiente tecnología²⁹^,³⁰. Sin embargo, algunos aspectos de la mayor miniaturización necesitan una cuidadosa consideración, tales como la evaporación de gotitas³¹ y la manipulación de microcristales³².

Por último, centrifugación de la placa (2.000 rpm, 1 minuto) podría integrarse como paso final rutina al configurar gotitas de cristalización (en los pozos de superior esféricas). Un tamaño y forma de las gotas resultantes de centrifugación más consistente pueden reducir problemas de reproducibilidad³³^,³⁴. Sin duda, gotas centradas facilitará la posterior evaluación de experimentos utilizando un microscopio como la longitud focal necesaria será similar en toda la placa.

3. ventajas del método 4-esquina

La ventaja más significativa del método 4-esquina es su simplicidad, que minimiza los errores y facilita sencillos protocolos automatizados. Por ejemplo, las soluciones de 4 esquina siempre se colocará en la cubierta de un líquido controlador siguiendo el mismo diseño. Además, todos los programas se basan en relaciones fijas entre las soluciones (figura 3).
Preparación manual de las soluciones de 4 esquina se prefiere al manejo automatizado de soluciones en las altas concentraciones que pueden ser altamente viscosas. Entonces es posible en la mayoría de los tipos de controladores de líquido con requisitos mínimos para la optimización de las clases de líquido relativamente rápido y preciso de aspiración/dispensación. Sin embargo, algunas soluciones de esquina pueden todavía ser demasiado viscosos para un robot con un sistema de líquido para funcionar eficientemente. Por esta razón, optamos por un controlador líquido con desplazamiento positivo (figura 3B).

Además de los 2 lineales gradientes de concentraciones, un tercer componente (es decir, un conjunto de buffers/aditivos) puede analizarse en una concentración constante de una manera conveniente. Para esto, un volumen relativamente grande de un conjunto básico de soluciones de esquina en una concentración más alta convenientemente, excluyendo el componente a ser variada, se prepara en primer lugar. Luego, soluciones incluyendo este componente se añade para ajustar las concentraciones finales. Por ejemplo, se preparan 50 mL de un conjunto de soluciones de esquina 4 en concentraciones más altas de 10% que inicialmente. Este conjunto básico es entonces dividida en 5 subconjuntos más pequeños de 4. Por último, 10% en volumen de soluciones de diferentes pH de buffer se agrega a cada subconjunto.

4. formatos y tipos de pantallas de aditivos

Las pantallas normalmente se almacenan a-20 ° C (figura 4), puesto que no se utilizan regularmente y contienen compuestos volátiles/inestable. El uso de una pantalla aditivo congelado en un bloque de pozo profundo (1 mL en los pozos) debe planificarse temprano porque tarda 12-24 horas para todas las soluciones aditivas se descongele completamente a temperatura ambiente. También, una multitud de usuarios compartir la misma pantalla aditiva, puede provocar problemas con la contaminación cruzada. Finalmente, la altura de pozos profundos bloques hace inadecuado para la mayoría nanoliter dispensadores. Como una solución conveniente para eludir estos problemas, la pantalla debe ser transferida desde el bloque de pozo profundo a las placas de bajo perfil (figura 4).

Históricamente, aditivas pantallas que incluyen una amplia variedad de reactivos individuales (con concentraciones individuales) han sido muy populares³⁵^,³⁶. Sin embargo, han desarrollado otros tipos de pantallas de aditivos que integran la mezcla de aditivos³⁷ o un número reducido de aditivos individuales en diferentes concentraciones³⁸. Por último, un enfoque complementario es investigar el efecto de aditivos sobre las muestras antes de la cristalización³⁹^,⁴⁰.

5. más consideraciones

Buenas prácticas: Mayoría de las pantallas contiene sustancias dañinas o incluso tóxicas y por lo tanto debe emplearse protección personal adecuada durante los protocolos. Igualmente, las piezas de los robots móviles pueden conducir a lesiones, sobre todo cuando se trata de interferir manualmente mientras está ejecutando un programa (aunque la mayoría de los robots tienen sistema/botón de parada de emergencia). Debido a las complejidades técnicas involucradas, regulares control de robots, pantallas y programas con caracterizado previamente muestras de prueba son importantes para el sostenido alto nivel de reproducibilidad.

Rendimiento: Como indicación, entre 4.000 a 8.000 LMB placas se producen anualmente con el sistema 1 (y posteriormente empleado por los usuarios para la investigación inicial). No se adapta a la acción una gran cantidad de placas similares previos a 10 ° C cuando el volumen de ventas esperado es mucho menor, como después de 4-5 meses, algunas condiciones comenzará a deteriorarse y se evaporan. Se han implementado diferentes enfoques para protocolos de automatización para laboratorios de tamaño pequeño a mediano⁴¹.

Almacenamiento y evaluación de experimentos: Después de preparar las gotitas, las placas se almacenan en estantes de baja vibración en una habitación a 4 o 18 ° C con temperatura bien controlada (+-0.5 ° C de desviación máxima). Experimentos se evaluaron mediante microscopios de fuente de luz fría. ¿Diversos sistemas de proyección de imagen automatizados están comercialmente disponibles, sin embargo uno debe considerar cuidadosamente todos los aspectos: la velocidad necesaria para analizar un plato será suficiente para alto rendimiento? ¿Objetos que no sean cristales interferirá en enfoque automático? ¿Será suficiente con puntos muy pequeños cristales (especialmente alrededor del borde de las gotitas) la calidad resultante de las imágenes? ⁴² ^, ⁴³ ^, ⁴⁴

Comparación de las condiciones de cristalización: Después de cuidadosa investigación acerca de la naturaleza de los cristales obtenidos inicialmente, uno puede analizar tendencias y similitudes a través de condiciones utilizando la base de datos de pantalla LMB o el C6 Herramienta Web⁴⁵.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

La instalación de cristalización de MRC-LMB es amablemente respaldado por el Medical Research Council (Reino Unido). Agradecemos a los miembros del LMB por su apoyo: Olga Perisic (PNAC) y Tony Warne, Fusinita Van den Ent, Pat Edwards (estudios estructurales), Steve Scotcher, los otros miembros del taller mecánico, Neil Grant y Jo Westmoreland (ayudas visuales), Paul Hart y Tom Pratt (IT). También nos gustaría dar las gracias a Steve Elliot (Tecan, Reino Unido), Mitchell Stuart y Heather Ringrose (robótica de Hamilton, Reino Unido), Paul Thaw, Robert Lewis y Joby Jenkins (TTP Labtech, UK), Paul Reardon (Swissci AG, Suiza), George Stephens y Donald Ogg (Alphabiotech, Reino Unido), Neil Williams (Markem Imaje, Reino Unido) y Graham Harris (la Agencia de Cleveland) para la ayuda técnica.

Materials

Robots
Freedom EVO®	Tecan	n/a	Liquid handler (System 1). Aspiration/Dispense based on system liquid. Integrates an automated carousel. EVOware plus controlling software v.2.4.12.0.
Microlab® STAR™	Hamilton	n/a	Liquid handler (System 2). Aspiration/Dispense based on positive displacement (CO-RE™ technology). Hamilton STAR controlling software v.4.3.5.4785 with method management interface.
Mosquito®	TTP Labtech	n/a	Microsyringe-based nanoliter dispenser used to set up droplets (System 2 and stand-alone), 3-position deck. Controlling software v.3.11.0.1422.
Dragonfly®	TTP Labtech	n/a	Syringe-based liquid handler used to produce optimization screens (4-corner method). Controlling software v.1.2.1.10196.
Adhesive plate sealer	Brandel	n/a	Integrated to Systems 1 and 2 (also used as stand-alone robot).
Inkjet printer 9232	Markem-Imaje	n/a	Integrated to System 1. Touchscreen interface.
Crystallization screens
Crystal Screen™ 1	Hampton Research	HR2-110	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB01
Crystal Screen 2™	Hampton Research	HR2-112	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB01
Wizard™ Classic 1	Rigaku	1009530	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB02
Wizard™ Classic 2	Rigaku	1009531	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB02
Grid Screen™ Ammonium Sulfate	Hampton Research	HR2-211	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03
Grid Screen™ PEG/LiCl	Hampton Research	HR2-217	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03
Quick Screen™	Hampton Research	HR2-221	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03
Grid Screen™ Sodium Chloride	Hampton Research	HR2-219	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03
Grid Screen™ PEG 6000	Hampton Research	HR2-213	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB04
Grid Screen™ MPD	Hampton Research	HR2-215	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB04
MemFac™	Hampton Research	HR2-114	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB04
PEG/Ion™	Hampton Research	HR2-126	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB05
Natrix™	Hampton Research	HR2-116	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB05
Crystal Screen Lite™	Hampton Research	HR2-128	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB06
Custom Lite screen	Molecular Dimensions Ltd	n/a	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB06
Wizard™ Cryo 1	Rigaku	1009536	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB07
Wizard™ Cryo 2	Rigaku	1009537	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB07
JBS1	JenaBioScience	CS-101L	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08
JBS2	JenaBioScience	CS-102L	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08
JBS3	JenaBioScience	CS-103L	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08
JBS4	JenaBioScience	CS-104L	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08
JBS5	JenaBioScience	CS-105L	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09
JBS6	JenaBioScience	CS-106L	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09
JBS7	JenaBioScience	CS-107L	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09
JBS8	JenaBioScience	CS-108L	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09
JBS9	JenaBioScience	CS-109L	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10
JBS10	JenaBioScience	CS-110L	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10
Clear Strategy™ Screen 1 pH 4.5	Molecular Dimensions Ltd	MD1-16LMB	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10
Clear Strategy™ Screen 1 pH 5.5	Molecular Dimensions Ltd	MD1-16LMB	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10
Clear Strategy™ Screen 1 pH 6.5	Molecular Dimensions Ltd	MD1-16LMB	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11
Clear Strategy™ Screen 1 pH 7.5	Molecular Dimensions Ltd	MD1-16LMB	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11
Clear Strategy™ Screen 1 pH 8.5	Molecular Dimensions Ltd	MD1-16LMB	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11
Clear Strategy™ Screen 2 pH 4.5	Molecular Dimensions Ltd	MD1-16LMB	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11
Clear Strategy™ Screen 2 pH 5.5	Molecular Dimensions Ltd	MD1-16LMB	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12
Clear Strategy™ Screen 2 pH 6.5	Molecular Dimensions Ltd	MD1-16LMB	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12
Clear Strategy™ Screen 2 pH 7.5	Molecular Dimensions Ltd	MD1-16LMB	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12
Clear Strategy™ Screen 2 pH 8.5	Molecular Dimensions Ltd	MD1-16LMB	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12
Index™	Hampton Research	HR2-144	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB13
SaltRX™ 1	Hampton Research	HR2-107	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB14
SaltRX™ 2	Hampton Research	HR2-109	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB14
MemStar™	Molecular Dimensions Ltd	MD1-21	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB15
MemSys™	Molecular Dimensions Ltd	MD1-25	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB15
JCSG-plus™ Suite	Qiagen	130720	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB16
MORPHEUS® screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-46	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB17
Pi minimal screen	JenaBioScience	CS-127	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB18
Pi-PEG screen	JenaBioScience	CS-128	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB19
MORPHEUS® II screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-91	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB20
LMB crystallization screen™	Molecular Dimensions Ltd	MD1-98	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB21
Additive screens
HT additive screen	Hampton Research	HR2-138	Frozen in 96-well deepwell block (1 mL per well).
MORPHEUS® additive screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-93-500	Frozen in 96-well deepwell block (500 µL per well).
ANGSTROM additive screen™	Molecular Dimensions Ltd	MD1-100	Frozen in 96-well deepwell block (1 mL per well).
MORPHEUS® additive screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-93	Frozen in 96-well cell culture Costar® plate with V-shaped wells (100 µL per well).
ANGSTROM additive screen™	Molecular Dimensions Ltd	MD1-100-FX	Frozen in 96-well cell culture Costar® plate with V-shaped well (100 µL per well).
HIPPOCRATES additive screen	Molecular Dimensions Ltd	n/a	48 single additives (drug compounds found in MORPHEUS® III).
Other consumables
96-well MRC 2-drop plate	Swissci	MRC 96T-UVP	Sitting-drop, vapor diffusion plate. Reservoir recommended volume: 80 µL. Range of useful droplet volumes: 10-1000 nL. UV transmissible.
48-well MRC 1-drop plate ('MAXI plate')	Swissci	MMX01-UVP	Sitting-drop, vapor diffusion plate for scale-up/optimization. Reservoir recommended volume: 200 µL. Range of useful droplet volumes: 0.1-10 µL. UV transmissible.
MRC hanging drop seal	Swissci	n/a	Hanging-drop, compatible with both MRC vapor diffusion plates (MRC 96T-UVP and MMX01-UVP ). UV and X-ray transmissible.
Adhesive sealing tape	Hampton Research	HR4-50	3-inch wide Duck® HD Clear™ for sealer and manual sealing.
Adhesive aluminium sheet	Beckman Coulter	538619	Used to reseal additive screens.
Ink cartridge	Markem-Imaje	9651	System 1 (inkjet printer).
Solvent cartridge	Markem-Imaje	8652	System 1 (inkjet printer).
50 µL tips	Hamilton	235947	System 2 (STAR™ liquid handler). Box of 6 sets with 1920 x CO-RE™ tips in disposable stacks.
Reagent container	Hamilton	194052	Used to dispense a condition into plate(s) during additive screening protocols.
PCR plate	Thermo Scientific™	AB-2150	System 2 (contains protein to be transfer to the Mosquito®). Abgene Diamond ultra, 384 V-shaped wells.
microsyringes	TTP Labtech	4150-03020	Spool of 26,000 microsyringes for the Mosquito® nanoliter dispenser (9mm spacing).
strip-holder block	TTP Labtech	3019-05013	SSB device for the Mosquito® strips, aka '4-way Reagent Holder'.
2 µL 8-well strip	TTP Labtech	4150-03110	Contains protein on the deck of the Mosquito®. Box of 40 strips, max. vol. in well is 3.2 µL.
5 µL 8-well strip	TTP Labtech	4150-03100	Contains protein on the deck of the Mosquito®. Box of 40 strips, max. vol. in well is 7.5 µL.
5 mL syringes	TTP Labtech	4150-07100	Syringe body and piston for the Dragonfly® liquid handler. Pack of 100.
Troughs/Reservoirs	TTP Labtech	4150-07103	Contains stock solutions on the deck of the Dragonfly®. Pack of 50.
Orbital microplate shaker	CamLab Limited	n/a	Variomag® for mixing conditions in a single plate (0-2000 rpm).
Microplate mixer	TTP Labtech	3121-01015	MxOne. Mixing condition in a single plate with 96 vibrating pins.

Referencias

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Gorrec, F., Löwe, J. Automated Protocols for Macromolecular Crystallization at the MRC Laboratory of Molecular Biology. J. Vis. Exp. (131), e55790, doi:10.3791/55790 (2018).

Automatizado de protocolos de cristalización Macromolecular en el laboratorio MRC de Biología Molecular

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