유동 세포 계측법에 의한 중추 신경계에서 유래 된 대장 세포 및 단구 세포 유래 대 식세포의 분석
Summary
이 프로토콜은 유행 세포 계측법에 의한 성체 마우스 중추 신경계에서 대 식세포 모집단의 분석을 제공하며, 이들 세포에 의해 표현되는 다중 마커의 연구에 도움이됩니다.
Abstract
수많은 연구가 중추 신경계 (CNS) 병리학에서 면역 세포, 특히 대 식세포의 역할을 입증했다. 중추 신경계에 두 가지 주요 대 식세포 개체군이있다 : (i) 중추 신경계의 상주 대 식세포이며 배아 발생 과정에서 난황낭 전구 세포에서 유래 된 미세 아교 세포 및 (ii) 단핵구에서 유래 된 대 식세포 (MDM) 질병 중 중추 신경계는 골수 선조 세포에서 유래한다. 각 macrophage subpopulation의 역할은 연구중인 병리학에 따라 다릅니다. 또한, 이러한 macrophage subpopulation에 사용되는 histological 마커 또는 구분 기준에 대한 합의가 없습니다. 그러나, 유동 세포 계측법에 의한 CD11b 및 CD45 마커의 발현 프로파일의 분석은 우리가 MDM (CD11b + CD45 high )으로부터 미 글 리아 (CD11b + CD45 med )를 구별 할 수있게한다. 이 프로토콜에서는 밀도 구배 원심 분리유동 세포 계측법 분석은이 CNS 대식 세포 하위 집단을 특성화하고 최근에 출판 한 것처럼 이들 세포가 나타내는 여러 마커를 연구하는데 사용될 수 있습니다. 따라서,이 기술은 신경 질환의 마우스 모델에서 대 식세포의 역할에 대한 우리의 이해를 더할 수 있으며, 또한 이들 세포에 대한 약물 효과를 평가하는데 사용될 수있다.
Introduction
미세 아교 세포는 중추 신경계 (CNS)의 실질 조직 내성 대 식세포입니다. 그들은 두 가지 중요한 기능적 역할을합니다 : 면역 방어와 CNS 항상성 유지. 골수에서 조혈 줄기 세포로부터 계속적으로 재생되는 MDM과 달리, 소구 세포는 배아 발달 중 뇌를 식민지로 만든 난황낭 (YS)에서 기원하는 조혈 전구 세포와 구별된다. 설치류에서 전사 인자 Myb는 모든 골수 유래 단핵 세포와 대 식세포의 발달에 중요한 역할을하지만, YS 유도 된 미세 아교 세포에 대해서는이 인자가 필요없고 분화는 전사 인자 PU.14에 의존한다.
건강한 CNS에서, 미세 아교 세포는 끊임없이 그들의 환경을 채취하는 역동적 인 세포입니다. sca침입하는 병원체 또는 조직 손상에 대한 육안 검사 및 측량 5 . 이러한 신호의 검출은 상해를 해결하기위한 경로를 시작합니다. microglia 신속하게 ramified 형태에서 amoeboid 하나, 다음 phagocytosis 및 프로 또는 항 염증성 cytokines 등 다양한 중재자의 릴리스 스위치. 따라서, 그들의 microenvironment에 따라, 활성화 된 microglia는 스펙트럼의 별개 프라이밍 상태 6을 얻을 수 있습니다.
microglia는 근본적으로 많은 신경 장애의 발달과 진행에 영향을 미칩니다. 알츠하이머 병 (AD) 7 , 근 위축성 측삭 경화증 (ALS) 8 , 다발성 경화증 (MS) 9 또는 파킨슨 병 (PD) 10 의 설치류 모델에서, 소아 글 리아는 해로운 신경 독성 또는 행동을 유도하는 이중 역할을하는 것으로 나타났다 신경 보호적인 방식으로,n 특정 질병, 병기 및 질병이 전신 면역 부 7 , 8 , 9 , 10 , 11의 영향을 받았는지 여부. 상기 언급 된 질병에서 관찰 된 대부분의 중추 신경계 병변은 실질 세포 미세 소견뿐만 아니라 혈관 주위 및 수막 상피 세포뿐만 아니라 중추 신경계 침윤성 MDM을 포함하는 골수 세포의 이종 집단을 포함한다. 이러한 세포 유형은 손상 및 수리와 관련된 병리학 적 기전에 차별적으로 기여할 수있다 ( 7 , 12 , 13 , 14 , 15) . 이러한 질병 모델을 연구하는 연구자가 현재 직면 한 문제는 말초 단핵 세포와 대 식세포가 CNS에 침투하는지 여부를 확인하는 것이고, 그렇다면 dist이 세포에서 상주 microglia를 잉태하십시오. 실제로, 소교 세포는 매우 플라스틱입니다. 그들이 활성화되면, microglia는 일반적으로 말초 monocytes 및 macrophages에 의해 표현되는 마커를 다시 표현합니다. 따라서이 문제는 상주 소아 글로불린과 침윤 단핵구 및 대 식세포를 구분할 수있는 마커를 확인하는 데 달려있다.
면역 조직 학적 적용에 의한 뇌 조각에 대한 이들 집단의 차별은 특이 항체가 부족하기 때문에 제한적이다. 그러나, 유동 세포 계측법 분석은 여러 마커의 발현을 평가하고 세포 집단 (예 : 림프구, 대 식세포 / MDM CD11b + CD45 high 및 microglia CD11b + CD45 med )을 구별하는 효율적인 기술이며 세포 아군 16 , 17 , 18 . 이 프로토콜은최적화 된 효소 조직 해리 및 밀도 구배 원심 분리를 사용하여 신경계 질환 모델에서 마우스 CNS 유래의 단핵구; 뿐만 아니라, 유동 세포 계측법을 사용하여 중추 신경계에서 미 글로리아 및 MDM 모집단을 구별하는 방법을 제공한다.
또 다른 접근법은 특정 항체 19 , 20 , 21에 접합 된 자기 구슬을 사용하여 미엘린을 제거하고 세포를 정제하는 것입니다. 안티 – myelin 자기 구슬을 사용하여 myelin 제거는 더 비싸며 분리 된 세포의 생존력과 수율에 영향을 미칩니다 22 . 이 단계와 microglia의 다음 immunomagnetic 분리는 특정 면역 세포 인구의 추가 연구를 제한 21 , 22 .
이 절차는 질병 발달에서 대 식세포 하위 집단을 연구하는 쉬운 방법을 제공하며,대 식세포 표현형 및 활성화 상태에 대한 약물 효과 또는 유전자 변형을 결정한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
microglia와 MDM은 중추 신경계에서 서로 다른 기능과 표현형을 가지고 있으며 따라서 대 식세포 subpopulation의 확인과 분석은 신경계 질환 9 , 18 , 25 를 더 잘 이해하기 위해 필수적이라는 것이 입증되었습니다. 두 마커 (CD11b 및 CD45)를 사용하여 유동 세포 계측법 분석은 각 하위 집단 사이의 구별을 허용합니다 ( 그?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 Agence Nationale Pour la Recherche (ANR-12-MALZ-0003-02-P2X7RAD), 협회 France Alzheimer 및 Bpifrance의 교부금으로 지원되었습니다. 우리 연구소는 Inserm, CNRS, Université Pierre et Marie-Curie 및 "Investissements d' avenir"ANR-10-IAIHU-06 (IHU-A-ICM) 프로그램도 지원합니다. CELIS 세포 배양 핵심 시설의 도움에 감사드립니다.
Materials
| 5-month-old Mice | Janvier | C57BL/6J | |
| Liberase TL Research Grade | Sigma-Aldrich | 5401020001 | Digestion enzyme |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| Percoll | GE Healthcare Life Sciences | 17-0891-01 | Density gradient medium |
| Cell Strainer size 70 µm Nylon | Corning | 731751 | |
| Venofix 25G | BRAUN | 4056370 | |
| Piston syringe 10 mL | Terumo | SS+10ES1 | |
| Pasteur pipette 230 mm | Dustcher | 20420 | |
| 1,5 mL tube | Eppendorf | 0030 123.328 | |
| 15 mL tube | TPP | 91015 | |
| 50 mL tube | TPP | 91050 | |
| 5 mL polystyrene round bottom tube | BD Falcon | 352054 | |
| D-PBS (1X) without Ca2+/Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| D-PBS (10X) without Ca2+/Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14200-067 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E4884 | |
| Bovine Serum Albumin solution 30% | Sigma-Aldrich | A7284 | |
| Paraformaldehyde 32% Solution | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Caution -Toxic |
| Saponin | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| PerCPCy5.5 Rat anti-mouse CD11b (clone M1/70) | eBioscience | 45-0112 | |
| Rat IgG2b K Isotype Control PerCP-Cyanine5.5 | eBioscience | 45-4031 | |
| BV421 Rat anti-mouse CD45 (clone 30-F11) | BD Biosciences | 563890 | |
| BV421 Rat IgG2b, κ Isotype Control RUO | BD Biosciences | 562603 | |
| Rabbit anti-mouse TMEM119 (clone28-3) | Abcam | ab209064 | |
| AlexaFluor 647 Donkey anti-rabbit IgG | Life Technologies | A31573 | |
| Anti-Mouse CD16/CD32 Purified | eBioscience | 14-0161 | Mouse Fc Block |
| Fixable Dead Cell Stain Kits | Invitrogen | L34969 | |
| Mouse CCR2 APC-conjugated Antibody | R&D | FAB5538A | |
| Rat IgG2B APC-conjugated Isotype Control | R&D | IC013A | |
| Mouse CX3CR1 PE-conjugated Antibody | R&D | FAB5825P | |
| Goat IgG PE-conjugated Antibody | R&D | IC108P | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
| Cell analyzer | BD Biosciences | BD FACSVERSE | |
| Data Analysis Software | FlowJo LLC | FlowJo | |
| Fine scissors | F.S.T | 14090-11 | |
| Standard Pattern Forceps | F.S.T | 11000-13 | |
| Mayo Scissors | F.S.T | 14010-15 | |
| Dumont #5 Forceps | F.S.T | 11251-20 |
Referencias
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