Análisis de las interacciones proteína-proteína y co-localización entre los componentes de la separación, estrecha, y adhiere a las uniones en las glándulas mamarias murinas
Summary
Las uniones intercelulares son requisitos para las funciones y desarrollo específicos de la glándula mamaria. Este manuscrito proporciona un protocolo detallado para el estudio de las interacciones proteína-proteína (IPP) y co-localización utilizando glándulas mamarias murinas. Estas técnicas permiten investigar la dinámica de la asociación física entre las uniones intercelulares en diferentes etapas del desarrollo.
Abstract
Las interacciones célula-célula juegan un papel fundamental en la preservación de la integridad del tejido y la barrera entre los diferentes compartimentos de la glándula mamaria. Estas interacciones son proporcionadas por proteínas de unión que forman nexos entre células adyacentes. La pérdida de función y, en consecuencia, la disfunción de los órganos, pueden producir una errónea asociación de proteínas de unión y una asociación física reducida con sus socios de unión. Por lo tanto, identificar la localización de proteínas y las interacciones proteína-proteína (IPP) en los tejidos normales y relacionados con la enfermedad es esencial para encontrar nuevas evidencias y mecanismos que conduzcan a la progresión de enfermedades o alteraciones en el estado de desarrollo. Este manuscrito presenta un método de dos pasos para evaluar los IBP en las glándulas mamarias murinas. En la sección de protocolo 1, se describe un método para realizar co-inmunofluorescencia (co-IF) usando anticuerpos contra las proteínas de interés, seguidos de anticuerpos secundarios marcados con fluorocromos. Aunque todos losOws para la demostración de la proximidad de las proteínas, permite estudiar sus interacciones físicas. Por lo tanto, se proporciona un protocolo detallado para co-inmunoprecipitación (co-IP) en la sección de protocolo 2. Este método se usa para determinar las interacciones físicas entre proteínas, sin confirmar si estas interacciones son directas o indirectas. En los últimos años, las técnicas co-IF y co-IP han demostrado que ciertos componentes de las uniones intercelulares co-localizan e interactúan entre sí, creando nexos de unión dependientes de la etapa que varían durante el desarrollo de la glándula mamaria.
Introduction
El crecimiento y desarrollo de la glándula mamaria ocurre principalmente después del nacimiento. Este órgano se remodela constantemente a lo largo de la vida reproductiva de un mamífero 1 . El epitelio de la glándula mamaria adulta está compuesto por una capa interna de células epiteliales luminales y una capa externa de células basales, compuestas principalmente por células mioepiteliales, rodeadas por una membrana basal 2 . Para una buena revisión sobre la estructura y desarrollo de la glándula mamaria, el lector puede referirse a Sternlicht 1 . Las interacciones célula-célula a través de la separación (GJ), estrecha (TJ), y adherens (AJ) las uniones son necesarias para el desarrollo normal y la función de la glándula 1 , 3 , 4 , 5 , 6 . Los componentes principales de estas uniones en la glándula mamaria murina son Cx26, Cx30, Cx32 y Cx43 (GJ); Claudin-1, -3, -4 y -7 yZO – 1 (TJ); Y E-cadherina, P-cadherina y β-catenina (AJ) 7 , 8 . Los niveles de expresión de estas diferentes proteínas de unión varían de una manera dependiente de la etapa durante el desarrollo de la glándula mamaria, lo que sugiere diferencial célula-célula interacción requisitos [ 9] . GJ, TJ y AJ están ligados estructural y funcionalmente y atar otras proteínas estructurales o reguladoras a los sitios vecinos de las células adyacentes, creando así un nexo de unión 10 . La composición del nexo de unión puede impactar el puente con el citoesqueleto subyacente, así como la permeabilidad y estabilidad del nexo, y por consiguiente puede influir en la función de la glándula 8 , 9 , 10 , 11 . Los componentes de las uniones intercelulares que residen en nexos de unión o que interactúan entre sí en difSe analizaron recientemente las diferentes etapas del desarrollo de la glándula mamaria con co-inmunofluorescencia (co-IF) y co-inmunoprecipitación (co-IP) 9 . Mientras que otras técnicas permiten la evaluación de la asociación funcional entre proteínas, estos métodos no se presentan en este manuscrito.
Como las proteínas simplemente actúan solas para funcionar, el estudio de las interacciones proteína-proteína (IPP), como las transducciones de señales y las cascadas bioquímicas, es esencial para muchos investigadores y puede proporcionar información significativa sobre la función de las proteínas. Co-IF y el análisis microscópico ayudan a evaluar algunas proteínas que comparten el mismo espacio subcelular. Sin embargo, el número de dianas está limitado por los anticuerpos, que deben ser criados en diferentes animales, y por el acceso a un microscopio confocal equipado con láseres de longitud de onda diferentes y un detector espectral para multiplexación. Co-IP confirma o revela interacciones físicas de alta afinidad entreEntre dos o más proteínas que residen dentro de un complejo de proteínas. A pesar del desarrollo de nuevas técnicas, como la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) 12 y el ensayo de ligación de proximidad (PLA) 13 , que pueden detectar simultáneamente la localización e interacciones de proteínas, el co-IP sigue siendo una técnica apropiada y asequible para estudiar interacciones entre Proteínas endógenas.
El método paso a paso descrito en este manuscrito facilitará el estudio de la localización de proteínas y los IBP y señalará las trampas a evitar al estudiar IPP endógenos en las glándulas mamarias. La metodología comienza con la presentación de los diferentes procedimientos de conservación de los tejidos necesarios para cada técnica. La parte 1 presenta cómo estudiar la co-localización de las proteínas en tres etapas: i) el corte de las glándulas mamarias, ii) el etiquetado doble o triple de diferentes proteínas mediante la técnica del co-IF, y iii)Localización de proteínas. La Parte 2 muestra cómo precipitar una proteína endógena e identificar sus proteínas que interactúan en tres etapas: i) preparación del lisado, ii) inmunoprecipitación indirecta de la proteína, y iii) identificación del asociado de unión por SDS-PAGE y Western blot. Cada paso de este protocolo se optimiza para tejidos de glándula mamaria de roedor y genera resultados de alta calidad, específicos y reproducibles. Este protocolo también puede utilizarse como punto de partida para estudios PPI en otros tejidos o líneas celulares.
Protocol
Representative Results
Discussion
Las interacciones célula-célula a través de las uniones son necesarias para el correcto funcionamiento y desarrollo de muchos órganos, como la glándula mamaria. Los estudios han demostrado que las proteínas de unión pueden regular la función y la estabilidad de unos a otros y activar la transducción de señales al atarse mutuamente en la membrana celular [ 10] . Los protocolos presentados en el actual manuscrito han proporcionado interesantes descubrimientos sobre la proteína de unión …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
IP es financiado por una beca del Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería del Canadá (NSERC # 418233-2012); Un Fondo de Investigación de Quebec-Santé (FRQS), un premio de carrera de la Fundación de Cáncer de Mama de Quebec y una subvención de Leader Founds de la Fundación Canadiense para la Innovación. ED recibió una beca de la Fundación universitaria Armand-Frappier.
Materials
| Mice strain and stage | St. Constant, Quebec, Canada | C57BL/6 Femals; pregnancy day 18 (P18) and lactation day 14 (L14), Charles River Canada | |
| PBS 10X (stock) | 1) Dissolve 80g NaCl (F.W.: 58.44), 2g KCl (F.W. 74.55), 26.8g Na2HPO4•7H2O (F.W. 268.07) and 2.4g KH2PO4 (F.W.:136.09) in 800ml distilled water. 2) Adjust the PH to 7.4 3) Add water to reach to the 1 litre final volume. |
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| TBS 10X (stock) | 1) Dissolve 60.5g TRIS, 87.6g NaCl in 800ml distilled water. 2) Adjust the PH to 7.5 3) Add water to reach to the 1 litre final volume. |
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| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Part 1-Immunofluorescence | |||
| Freezing media | VWR International, Ville Mont-Royal, QC, Canada | 95067-840 | VMR frozen sections compound |
| Microtome | Mississauga, ON, Canada | 956640 | Microm HM525, Thermo fisher scientific HM525 NX Cryostat 115V 60Hz |
| Blades | C.L. Sturkey, Inc. Les Produits Scientifiques ESBE St-Laurent, QC, Canada | BLM1001C | High profile gold coated blades |
| Pap pen | Cedarlane, Burlington, ON, Canada | 8899 | Super PAP Pen, Thermo fisher scientific |
| Microscopic slides | Fisher Scientific, Burlington, ON, Canada | 12-550-15 | Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides |
| Formaldehyde | BioShop Canada Inc, Burlington, ON, Canada | FOR201.1 | Forlmadehyde |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA | ||
| Blocking solution | 3% BSA in TBS | ||
| Wash solution | TBS-Tween 20 0.1% | ||
| Polysorbate 20 | Oakville, ON, Canada | P 9416 | Tween 20, Sigma-Aldrich |
| Mounting media | Cedarlane, Burlington, ON | 17984-25(EM) | Fluoromount-G |
| First & secondary antibodies | Cell Signaling, Beverly, MA, USA | Mentioned in Column D | E-Cadherin (4A2) Mouse mAb (#14472s) 1/50 (Cell Signaling) with anti-mouse IgG Fab2 Alexa Fluor 555 (#4409s), Cell Signaling |
| First & secondary antibodies | Life technologies, Waltham, MA, USA & Cell Signaling, Beverly, MA, USA | Mentioned in Column D | Claudin-7 (#34-9100) 1/100 (Life Technologies) with anti-rabbit IgG Fab2 Alexa Fluor 488 (#4412s) (Cell Signaling) |
| First & secondary antibodies | Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA; Fischer Scientific, Burlington, ON, Canada | Mentioned in Column D | β-Catenin Antibody (C-18): sc-1496 (SANTA CRUZ) with anti-Goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 (#A11057), Molecular Probe (Fisher Scientific) |
| First & secondary antibodies | Life technologies, Waltham, MA, USA & Cell Signaling, Beverly, MA, USA | Mentioned in Column D | Connexin26 (#33-5800) 1/75 (Life Technologies) with anti-mouse IgG Fab2 Alexa Fluor 647 (#4410s) |
| Nuclei stain | Fisher Scientific, Burlington, ON, Canada | D1306 | DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) 1/1000 in PBS |
| Fluorescent microscope | Nikon Canada, Mississauga, On, Canada | Nikon A1R+ confocal microscopic laser equipped with a spectral detector | |
| Software of IF images analysis | Nikon Canada, Mississauga, On, Canada | NIS-elements software (version 4) | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Part 2-Immunoprecipitation | |||
| Triple-detergent Lysis buffer (100ml) pH=8.0 | 1) Mix 50mM TRIS (F.W. :121.14), 150mM NaCl (F.W. :58.44), 0.02% Sodium Azide, 0.1% SDS, 1% NONIdET P40, 0.5% Sodium Deoxycholate in 80ml distilled H2O. 2) Adjust the PH to 8.0 with HCl 6N (~0.5ml). 3) Adjust the volume to 100ml. Keep it in fridge. At the day of protein extraction, use 1/100 NaVo3, 1/100 protease/phosphatase inhibitor and 1/25 NAF in calculated amount of Triple detergent lysis buffer: Sodium Fluorid (stock) solution 1.25M (F.W. 41.98), Sodium Orthovanadate (stock) Solution 1M (F.W.: 183.9) |
||
| Protease/phosphatase inhibitor | Fisher Scientific, Burlington, ON | 78441 | Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, EDTA-free (100X) |
| Protein dosage | Thermo Scientific, Rockford, Illinois, USA | 23225 | Pierce BCA protein assay kit |
| Tissue grinder | Fisher Scientific, Burlington, ON | FTH-115 | Power 125, Model FTH-115 |
| Magnetic beads and stand | Millipore, Etobicoke, ON, Canada | PureProteome Protein G Magnetic Bead System (LSKMAGG02) | |
| Wash solution for IP | PBS or PBS-Tween20 0.1% depending to the step | ||
| Primary antibodies for immunoprecipitation | Cell Signaling, Beverly, MA, USA | Mentioned in coulmn D | IgG Rabbit (rabbit (DA1E) mAb IgG Isotype control (#3900s) (Cell Signaling) 0.5 µl/200 µl |
| Primary antibodies for immunoprecipitation | Cell Signaling, Beverly, MA, USA | Mentioned in coulmn D | IgG Mouse mouse (G3A1) mAb IgG Isotype control (#5415s) (Cell Signaling) 0.5 µl/200 µl |
| Primary antibodies for immunoprecipitation | Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Canada | Mentioned in coulmn D | Connexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 4 µl/200 µl |
| Primary antibodies for immunoprecipitation | Cell Signaling, Beverly, MA, USA | Mentioned in coulmn D | E-cadherin (4A2) Mouse mAb (#14472s) (Cell Signaling) 1 µl/200 µl |
| Laemmli buffer | BIO-RAD, Mississauga, Ontario, Canada | 1610747 | 4x Laemmli Sample Buffer (Add β-mercaptoethanol following manufacturer recommendation) |
| Acidic glycine | Fisher Scientific, Burlington, ON | PB381-5 | 0.2 M glycine; adjust pH=2.5 with HCl |
| Tris | Fisher Scientific, Burlington, ON | BP152-1 | 1 M (pH=8) |
| SDS-PAGE acrylamide gels | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1610180 -5 | TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Solutionss (7.8%, 10%, 12%) |
| Running buffer 10x | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1704272 | Tris 30.3g/glycine 144.1g /SDS 10g in 1 litre distilled water |
| Membranes | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1704272 | PVDF membranes, Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF Transfer Kit |
| Transfer method | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1704155 | Trans-Blot Turbo Transfer System |
| Dry Milk | Smucker Food of Canada Co, Markham, ON, Canada | Fat Free Instant Skim Milk Powder, Carnation | |
| Blocking solution for blots | 5% dry milk in TBS-Tween 20 0.1% | ||
| Washing solutions for blots | TBS-Tween 20 0.1% | ||
| Primary and secondary antibodies for blots (10ml) | Sigma-Aldrich, Oakville, Ontario & Abcam, Toronto, ON, Canada | Mentioned in column D | Connexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 1/2500 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5000 (Abcam, Toronto, ON, Canada) |
| Primary and secondary antibodies for blots (10ml) | Cell Signaling, Beverly, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada | Mentioned in column D | E-cadherin (24E10) rabbit mAb 1/1000 (#3195s) (Cell Signaling) 1/1000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5000 (Abcam, Toronto, ON, Canada) |
| Primary and secondary antibodies for blots (10ml) | Life technologies, Waltham, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada | Mentioned in column D | Claudin-7 (#34-9100) (Life technologies) 1/1000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5000 (Abcam, Toronto, ON, Canada) |
| Primary and secondary antibodies for blots (10ml) | Life technologies, Waltham, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada | Mentioned in column D | Claudin3 (#34-1700) (Life technologies) 1/1000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5000 (Abcam, Toronto, ON, Canada) |
| Luminol solution for signal detection on blots | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1705061 | Clarity Western ECL Blotting Substrate |
| Imaging blots | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1708280 | ChemiDoc MP imaging system |
| Analayzing blots | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | ImageLab 5.2 software | |
Referencias
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