Personalizzato aghi per microiniezioni nel cervello del roditore
Summary
Descriviamo qui un protocollo per il microinjection nel cervello del roditore che utilizza aghi di quarzo. Questi aghi non producono danni rilevabili del tessuto e garantire la consegna affidabile anche in regioni profonde. Inoltre, può essere adattati alle esigenze di ricerca di disegni personalizzati e può essere riutilizzati.
Abstract
Microiniezioni sono stati utilizzati per un lungo tempo per la consegna di farmaci o tossine all’interno di specifiche aree cerebrali e, più recentemente, sono stati utilizzati per fornire prodotti di terapia genica o cellulare. Purtroppo, le attuali tecniche di microiniezione utilizzano aghi in acciaio o vetro che sono non ottimali per molteplici ragioni: in particolare, aghi d’acciaio possono causare danni ai tessuti, e aghi di vetro possono piegarsi quando abbassato profondamente nel cervello, mancante della regione di destinazione. In questo articolo, descriviamo un protocollo per preparare e utilizzare aghi di quarzo che combinano una serie di funzioni utili. Questi aghi non producono danni rilevabili del tessuto e, essendo molto rigida, garantire la consegna affidabile nella regione del cervello desiderata anche quando si utilizza coordinate profonde. Inoltre, è possibile personalizzare il design dell’ago facendo più fori del diametro desiderato. Più fori di facilitano l’iniezione di grandi quantità di soluzione all’interno di un’area più ampia, mentre grandi fori facilitano l’iniezione delle cellule. Inoltre, questi aghi di quarzo possono essere puliti e riutilizzati, tale che la procedura diventa conveniente.
Introduction
Microiniezioni sono stati utilizzati per un lungo tempo per la consegna di composti farmacologicamente attivi di modulare l’attività neuronale in specifiche aree cerebrali. Inoltre, sono stati utilizzati per iniettare tossine vicino particolare popolazioni neuronali, per simulare eventi neurodegenerative caratteristici di alcune malattie, ad esempio 6-idrossi-dopamina nel sistema nigrostriatal della dopamina per imitare la malattia del Parkinson 1 , 2 o l’immunotossina 192 IgG saporin ha a lesione del sistema colinergico3. Più recentemente, procedure di microiniezione sono state utilizzate per trasportare gli innesti vettori o cellule virali per la terapia genica o delle cellule di cervello sperimentale disturbi4,5.
Il tipo classico di aghi impiegati in questi studi è fatto di acciaio inossidabile. Anche se facile e pratico da usare, aghi in acciaio hanno un numero di problemi6: essi sono relativamente grandi e può causare danni ai tessuti, con perdita della barriera sangue – cervello e attivazione degli astrociti; Inoltre, possono produrre carotaggio del tessuto cerebrale che ottiene nell’ago creando un ostacolo o persino completamente evitando il flusso della soluzione desiderata. Più recentemente, aghi di vetro preparati ad hoc dai vasi capillari sono stati introdotti in usano7,8. Questi non causano l’attivazione di danni né Astrocita significativa del tessuto, ma sono relativamente flessibili e possono piegarsi quando introdotto in strutture profonde, riducendo la precisione della localizzazione (osservazioni personali).
Esiste quindi la necessità di ridurre quanto più possibili danni (soprattutto durante gli esperimenti per curare i danni), aumentando la precisione e la riproducibilità (cioè, garantire che tutta la soluzione viene consegnata e garantire la corretta localizzazione). Inoltre, sarebbe auspicabile utilizzare disegni differenti dell’ago per assicurare una distribuzione ottimale della soluzione iniettata nelle aree del cervello con geometrie variabili. In questo articolo, descriviamo un protocollo per preparare e utilizzare il quarzo aghi per microiniezioni nel cervello del roditore. Dovuto l’alto punto di fusione, quarzo capillari non possono essere tirati su un estrattore convenzionale e pertanto, non sono stati utilizzati in passato per generare gli aghi. Quarzo, tuttavia, offre alcuni importanti vantaggi rispetto a vetro, in particolare ad alta rigidità e rottura resistenza9. A causa della loro rigidità, aghi di quarzo sono ideali per iniezioni nelle regioni ventrali del cervello. A causa della loro elevata resistenza alla rottura può essere modellate per includere più fori, ottenendo disegni che possono rivelarsi più efficaci anche quando la destinazione di regioni del cervello con geometrie complesse10.
Protocol
Representative Results
Discussion
La tecnica descritta in questo articolo soddisfa le esigenze descritte nell’ Introduzione per l’ottimizzazione di microiniezioni che vengono eseguite per vari scopi12. Gli aghi descritti qui riducono i danni a un livello minimo, essenzialmente non rilevabili; alla varianza con aghi di vetro (che sono inclini a piegare), quarzo aghi sono rigidi e garantiscono un successo affidabile della regione cerebrale desiderata anche in profonde coordinate. Inoltre, il foro laterale assicura l…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Quest’opera è stata sostenuta da una sovvenzione della Comunità europea [progetto FP7-persone-2011-IAPP 285827 (EPIXCHANGE)].
Materials
| Quartz capillaries | Sutter Instruments, Novato, CA USA | Q100-50-10 | Without filament |
| Puller | Sutter | P2000 | |
| Micropipette storage jar | World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA | E210 | |
| Laser microdissector | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | LMD6500 | |
| Hamilton syringe | Hamilton ILS Innovative Labor Systeme GmbH, StŸtzerbach, Germany | 19138-U | |
| Microinfusion pump | Univentor, Zejtun, Malta | Model 864 | |
| Manual microinjection pump kit | WPI | Item#: MMP-KIT | Kit allowing for micropipettes to be securely mounted to the stereotactic frame |
| Precision Drill | Proxxon | 28510 MicroMot 50/E | Ball bearing drive shaft with variable speed |
| Artficial Cerebral Spinal Fluid | Tocris | 3525 | |
| Needles 26 G Blunt and 30 G Bevel | Hamilton | 26 G Blunt: 19138-U 30 G Bevel: 20757 |
|
| Microtome | Leica, Germany | LEICA RM212RT |
Referencias
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