잠재적 인 세포질 대체 요법을위한 골수 간엽 줄기 세포로부터의 혈장 막 소포의 제조
Summary
연령 관련 질환은 세포질 구성 요소의 여러 결함과 관련이 있습니다. 여기, 우리는 골수 간엽 줄기 세포에서 플라즈마 막 소포를 준비하는 프로토콜을 제시합니다. 이 기법은 연령 관련 phenotypes을 개선하거나 심지어 심지어 세포질 대체 요법의 수단으로 잠재적으로 사용할 수 있습니다.
Abstract
우리는 이전에 포유류 세포의 기계적 압출을 통한 원형질막 소포 (PMVs)의 생성에 대해보고했다. 미토콘드리아 결핍 Rho0 세포와 PMVs의 융합은 정상적인 배양 조건 하에서 유사 분열 활성을 회복시켰다. 죽상 동맥 경화증, 제 2 형 당뇨병, 알츠하이머 병 및 암은 다양한 세포 유형의 세포질 및 세포 소기관에서 여러 가지 기계적 및 기능적 결함과 관련이 있다고보고 된 연령 관련 질환입니다. 골수 간엽 줄기 세포 (bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)는 다 기능성을 유지하면서자가 재생 능력을 보유한 골수에서 유래 된 독특한 세포 집단을 대표합니다. PMVs의 융합을 통한자가 BMSCs로부터의 어린 세포질을 가진 노화 세포의 보충은 노화와 연관된 표현형을 개선하거나 심지어 역전시키는 유망한 접근법을 제공한다. 이 프로토콜은 압출을 통해 BMSC에서 PMV를 준비하는 방법을 설명합니다.1, 공극, 미토콘드리아의 존재를 결정하고 공 촛점 현미경을 사용하여 PMV 내의 막 전위의 유지를 검사하고, 원심 분리에 의해 PMV를 농축하고 생쥐의 비복근 내로 PMV의 생체 내 주입을 수행한다.
Introduction
유전자, 효소 및 세포 대체 요법에 대한 접근법을 수립하는데 엄청난 노력이 기울여왔다. 이것은 획기적인 발전을 가져 왔고 심지어 임상 적용 1 , 2 , 3을 가져 왔습니다. 최근 핵 전달 기술에 기반을 둔 논란이되고있는 미토콘드리아 보충 요법이 노년기 여성 또는 치명적인 mitochondrial DNA 돌연변이를 가지고있는 체외 수정에 적용되었습니다. 아테롬성 동맥 경화증, 2 형 당뇨병, 알츠하이머 병 및 암을 포함한 연령 관련 질환에서 발견되는 결함은 대개 다각적입니다. 지질 방울의 축적이 문서화되어있다. 아밀로이드 단백질의 침전; 소포체에서 전개되지 않은 단백질의 유지; autophagosome, mitochondria가 이들 질병의 발달 또는 악화에 기여한다."xref"> 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . 현재, 노화 및 노화 표현형을 일으키는 세포질 및 세포 기관에서의 오작동의 직접적인 개선을 목표로하는 이용 가능한 메커니즘이 없다.
우리는 이전에 포유 동물 세포의 기계적 압출을 통해 플라즈마 막 소포 (PMVs)의 생성에 대해보고했습니다 12 . 핵을 제외하고는 미토콘드리아와 같은 세포 소기관뿐만 아니라 단백질과 RNA를 비롯한 막 또는 세포질의 구성 요소가 PMV에서 발견되었습니다. 본질적으로, PMV는 소형 핵 세포로 간주 될 수 있습니다. 더 중요한 것은, 미토콘드리아 결핍 Rho0 세포와 PMVs의 융합은 정상적인 문화 조건 하에서 mitotic 활동을 복원했다. 이것은 첫 번째 보고서입니다.세포질 대체 요법을위한 잠재적으로 효율적인 접근 방법을 제시하고있다.
골수 간엽 줄기 세포 (bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)는 골수에서 일상적으로 생성되는 다 분화 선조 세포 (multipotent progenitor cell)이며 배양 물에서 쉽게 확장됩니다. 배아 줄기 세포 마커 Oct4, Nanog 및 SOX2는 MSCs 13 에서 낮은 수준으로 검출되었다. 텔로 머라 아제 활성도 측정 가능합니다. 또한 MSC에서의 낮은 HLA Class I 발현뿐만 아니라 공동 자극 분자 및 인간 백혈구 항원 (HLA) 클래스 II 분자의 부재는 동종 이성체 또는 "기성품 인"사용에 이상적인 세포로 작용합니다. 재생 의학 및 면역 조절 응용 14 .
여기, 우리는 3 μm의 공극을 가진 폴리 카보 네이트 멤브레인을 통해 압출을 통해 마우스 BMSC에서 PMV를 준비하는 방법, 미토콘드리아의 존재를 결정하는 방법 및 PMV에서 멤브레인 잠재력의 유지를 검사하는 방법을 설명합니다.현미경 검사법으로 원심 분리에 의해 응축 된 PMV가 아닌 농축 된 PMV를 준비하고 PMV를 생쥐의 비복근 내로 주입합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cytoplasm replacement therapy as proposed in this manuscript has unique advantages over other reported approaches such as gene, molecular, and cell therapy. PMVs generated from BMSCs encapsulate not only the products of stemness genes but also intact cellular organelles, which are essential to remedy the ageing phenotypes associated with senescence. When young cytoplasm is delivered to senescent cells, the malfunctioning mechanisms may gain a brief relief; at the same time, the epigenome could be reprogrammed and invigor…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 중국의 자연 과학 재단 (http://www.nsfc.gov.cn/ Grant No. 30971665)의 Li Ka Shing Foundation, 광동 고 수준 대학 프로젝트 "해양 산업을위한 녹색 기술" 81172894, 81370925) 및 광동 교육부 (http://www.gdhed.edu.cn/ 보조금 번호 cxzd1123).
Materials
| IsoporeTM membranes | Millipore | TSTP04700 | 3 mm pore |
| Disposable filter unit | Xinya, Shanghai, China | 25 mm | Medical grade polypropylene |
| Insulin syringe | BD | 328446 | 1 ml |
| pN1-EGFP | Clontech | 6085-1 | |
| MitoTracker | Molecular Probes | M7514 | Green FM, 1 μM |
| JC-1 | Beyotime, Haimen, China | C2006 | 10 mg/ml |
| CM-DiI | Beyotime, Haimen, China | C1036 | 10 mM |
| PEI | Sigma | P3143 | Mn = 75000 |
| Fluorescence Microscope | Nikon | Eclipse TE 2000 | With CCD camera |
| Confocol Microscope | Carl Zeiss | LSM 510 Meta | |
| PolyJet | SigaGen | SL100688 | For cell transfection |
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