Summary

Differentiatie van chondrocyten van perifere bloed afgeleide humane geïnduceerde pluripotente stamcellen

Published: July 18, 2017
doi:

Summary

Wij presenteren een protocol voor het genereren van een chondrogeen afkomst van menselijk perifere bloed (PB) via geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) met behulp van een integratievrije methode, waaronder embryoïde lichaamsvorming (EB), uitbreiding van fibroblastische cellen en chondrogeeninductie.

Abstract

In deze studie hebben we perifere bloedcellen (PBC's) als zaadcellen gebruikt om chondrocyten te produceren via geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) in een integratievrije methode. Na de vorming van embryoïde lichaam (EB) en fibroblastische celuitbreiding worden de iPSC's geïnduceerd voor chondrogeen differentiatie gedurende 21 dagen onder serumvrije en xeno-vrije condities. Na chondrocytische inductie worden de fenotypes van de cellen geëvalueerd door morfologische, immunohistochemische en biochemische analyses, evenals door het kwantitatieve real-time PCR onderzoek van chondrogeen differentiatie markers. De chondrogeenpellets tonen positieve alcianblauw en toluidine blauwkleuring. De immunohistochemie van collageen II en X-kleuring is ook positief. Het gesulfateerde glycosaminoglycan (sGAG) gehalte en de chondrogeen differentiatie merkers COLLAGEN 2 ( COL2 ), COLLAGEN 10 ( COL10 ), SOX9 es AGGRECAN worden significant in de chronisch gereguleerdRogenic pellets vergeleken met hiPSCs en fibroblastische cellen. Deze resultaten suggereren dat PBC's kunnen worden gebruikt als zaadcellen om iPSC's te genereren voor kraakbeenherstel, dat is patiëntspecifiek en kosteneffectief.

Introduction

Kraakbeenweefsel heeft een zeer slechte capaciteit voor zelfherstel en regeneratie. Diverse chirurgische interventies en biologische behandelingen worden gebruikt om kraakbeen- en gewrichtsfunctie te herstellen, met onbevredigende resultaten. De recente ontwikkeling van stamceltechnologie kan het hele kraakbeenherstelveld 1 veranderen . Verschillende stamcellen zijn als zaadcellen bestudeerd, maar door mensen geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's) lijken de meest veelbelovende keuzes te zijn, omdat ze vele soorten patiëntenpecifieke cellen kunnen leveren zonder afwijzingsreacties te veroorzaken 2 . Bovendien kunnen ze de beperkte proliferatieve aard van volwassen cellen overwinnen en hun zelfvernieuwende en pluripotente vaardigheden handhaven. Bovendien kan gen targeting gebruikt worden om het genotype te veranderen om specifieke soorten chondrocyten te verkrijgen.

Fibroblasten zijn veel gebruikt om iPSCs te genereren, omdat hun herprogrammeringspotenties ook goed bestudeerd zijn.Er zijn echter nog enkele beperkingen die moeten worden overwonnen, zoals de pijnlijke biopsie van patiënten en de noodzaak voor de in vitro- uitbreiding van de fibroblasten, die kan leiden tot genmutaties 3 . Onlangs bleken PBC's voordelig te zijn voor herprogrammering 4 ; Bovendien werden ze veelal gebruikt en overvloedig opgeslagen. Het is mogelijk dat ze de studiefocus van de huid kunnen doorsturen. Naar ons beste weten, zijn er maar weinig rapporten over PBC-herprogrammering gevolgd door differentiatie in chondrocyten.

In de huidige studie gebruiken we PBC's als een alternatieve bron door ze in iPSCs te programmeren en vervolgens de iPSC's te differentiëren in de chondrogene lijn door middel van een pelletcultuur systeem om chondrocytevorming na te bootsen.

Protocol

Het protocol voor het genereren van hiPSC's van PBC's is te vinden in onze vorige studie 5 . De studie is goedgekeurd door de Institutional Review Board van onze instelling. 1. Embryoid Body (EB) Formation Maak 50 ml hiPSC-medium: Knockout Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 15% knock-out serumvervanging (KSR), 5% foetaal bees serum (FBS), 1 x niet-essentiële aminozuren, 55 μM 2-mercaptoethanol, 2 mM L -glutamine, en 8 ng / m…

Representative Results

Chondrogen Differentiatie van hiPSCs: EB formatiemedium en basaal cultuurmedium werden gebruikt om de hiPSC's te differentiëren in de mesenchymale afstamming. Een multi-step cultuur methode werd gebruikt ( Figuur 1 ). Ten eerste werden de hiPSC's spontaan gedifferentieerd via EB-vorming gedurende 10 dagen (D10; Figuur 2A ). Ten tweede kwamen cellen nog 10 dagen …

Discussion

Hier leveren we een protocol om chondrocyten van PBC's te genereren via iPSCs. Omdat PBC's meer voorkomend zijn en veel gebruikt worden op het klinisch gebied, worden ze gepresenteerd als een mogelijk alternatief voor herprogrammering. In deze studie werden episomale vectoren (EV) gebruikt om PBC's in iPSC's te herprogrammeren, volgens de methode die door Zhang et al werd vastgesteld. 11 . Deze integratievrije aanpak houdt in dat er geen virusgeassocieerde genotoxiciteit …

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs willen Xiaobin Zhang bedanken voor zijn plasmide. We bedanken ook Shaorong Gao en Qianfei Wang voor hun vriendelijke hulp tijdens het experiment. Deze studie wordt ondersteund door de Nationale Natuurwetenschappenstichting van China (nr.81101346, 81271963, 81100331), het Beijing 215 hoogwaardige talentproject (nr.2014-3-025) en het Beijing Chao-Yang Hospital Fund (nr. . CYXX-2017-01) en de Youth Innovation Promotion Association van de Chinese Academie voor Wetenschappen (YL).

Materials

Knockout DMEM Invitrogen 10829018 Basal medium used for hiPSC culture and EB formation medium
Knockout Serum Replacement (KSR) Invitrogen 10828028 A more defined, FBS-free medium supplement used for hiPSC culture and EB formation medium
Fetal bovine serum (FBS) Hyclone sh30070.03 Used for hiPSC culture and EB formation medium,offers excellent value for cell culture
Nonessential amino acids Chemicon TMS-001-C Used as a growth supplement in all the cell culture medium, to increase cell growth and viability
L-glutamine Invitrogen 35050061 An amino acid required for cell culture
Basic fibroblast growth factor (bFGF) Peprotech 100-18B A cytokine used for sustaining the pluripotency and self-renewal of hiPSCs
Dispase Invitrogen 17105041 Used for hiPSC dissociation for subculture
DMEM Gibco C11960 Basal medium used for MSC culture medium
0.1% gelatin Millipore ES-006-B Used for cell attachment onto the dishes
0.25% trypsin/EDTA Gibco 25200072 Used for cell dissociation
DPBS Gibco 14190250 A balanced salt solution used for cell wash or reagent preparing
β-mercaptoethanol invitrogen 21985023 Used as a growth supplement in all the cell culture medium.
ITS invitrogen 41400045 Insulin, Transferrin, Selenium Solution.Used for chondrogenic differentiation.
Ascorbic acid Sigma 4403 Known as vitamin C. It helps in active growth and has antioxidant property.
Sodium pyruvate Gibco 11360070 Added to cell culture medium as an energy source in addition to glucose.
Transforming growth factor-beta 1 Peprotech AF-100-21C A cytokine that regulate cell proliferation, growth and chondrogenic differentiation.
Rabbit polyclonal antibodies against Collagen II Abcam ab34712 This antibody reacts with Type II collagens,which is specific for cartilaginous tissues.
Mouse monoclonal antibodies to Collagen X Abcam ab49945 This antibody reacts with Type X collagen,which is a product of hyperthrophic chondrotocytes.
Permount Fisher Scientific SP15-100 For mounting and long-term storage of slides
Toluidine blue Sigma 89640 Used for proteoglycans detection.
Alcian blue Amresco #0298 Used for glucosaminoglycans detection.
Papain Sigma P4762-25MG Used to digest chondrogenic pellets.
Dimethylmethylene blue Sigma 341088-1G Used to quantitate glycosaminoglyans
Chondroitin sulfate sodium salt from shark cartilage Sigma C4384-250MG Used to draw the standard curve for sGAG content measurement.
Qubit dsDNA HS assay kit Invitrogen Q32851 (100) Used to determine DNA content
TRIzol Invitrogen 15596018 Used for RNA isolation from cells
Reverse Transcriptase System Promega A3500 Used to convert RNA into cDNA
SYBR FAST qPCR kit Master Mix Kapa KK4601 Used for Real-time PCR

Referencias

  1. Diekman, B. O., et al. Cartilage tissue engineering using differentiated and purified induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (47), 19172-19177 (2012).
  2. Park, I. H., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134 (5), 877-886 (2008).
  3. Loh, Y. H., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human blood. Blood. 113 (22), 5476-5479 (2009).
  4. Zhang, X. B. Cellular reprogramming of human peripheral blood cells. Genomics Proteomics Bioinformatics. 11 (5), 264-274 (2013).
  5. Li, Y., et al. Reprogramming of blood cells into induced pluripotent stem cells as a new cell source for cartilage repair. Stem Cell Res Ther. 7 (31), (2016).
  6. Canene-Adams, K. Preparation of formalin-fixed paraffin-embedded tissue for immunohistochemistry. Methods Enzymol. 533, 225-233 (2013).
  7. Solchaga, L. A., Penick, K. J., Welter, J. F. Chondrogenic differentiation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells: tips and tricks. Methods Mol Biol. 698, 253-278 (2011).
  8. Oldershaw, R. A., et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells toward chondrocytes. Nat Biotechnol. 28 (11), 1187-1194 (2010).
  9. Monje, L., Varayoud, J., Luque, E. H., Ramos, J. G. Neonatal exposure to bisphenol A modifies the abundance of estrogen receptor alpha transcripts with alternative 5′-untranslated regions in the female rat preoptic area. J Endocrinol. 194 (1), 201-212 (2007).
  10. Teramura, T., et al. Induction of mesenchymal progenitor cells with chondrogenic property from mouse-induced pluripotent stem cells. Cell Reprogram. 12 (3), 249-261 (2010).
  11. Su, R. J., et al. Efficient generation of integration-free ips cells from human adult peripheral blood using BCL-XL together with Yamanaka factors. PLoS One. 8 (5), e64496 (2013).
  12. Carey, B. W., et al. Reprogramming factor stoichiometry influences the epigenetic state and biological properties of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 9 (6), 588-598 (2011).
  13. Okita, K., et al. An efficient nonviral method to generate integration-free human-induced pluripotent stem cells from cord blood and peripheral blood cells. Stem Cells. 31 (3), 458-466 (2013).
  14. Staerk, J., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7 (1), 20-24 (2010).
  15. Qu, C., et al. Chondrogenic differentiation of human pluripotent stem cells in chondrocyte co-culture. Int J Biochem Cell Biol. 45 (8), 1802-1812 (2013).
  16. Guzzo, R. M., Gibson, J., Xu, R. H., Lee, F. Y., Drissi, H. Efficient differentiation of human iPSC-derived mesenchymal stem cells to chondroprogenitor cells. J Cell Biochem. 114 (2), 480-490 (2013).
  17. Koyama, N., et al. Human induced pluripotent stem cells differentiated into chondrogenic lineage via generation of mesenchymal progenitor cells. Stem Cells Dev. 22 (1), 102-113 (2013).
  18. Liu, X., et al. Role of insulin-transferrin-selenium in auricular chondrocyte proliferation and engineered cartilage formation in vitro. Int J Mol Sci. 15 (1), 1525-1537 (2014).
  19. Guzzo, R. M., Scanlon, V., Sanjay, A., Xu, R. H., Drissi, H. Establishment of human cell type-specific iPS cells with enhanced chondrogenic potential. Stem Cell Rev. 10 (6), 820-829 (2014).
  20. Goepfert, C., Slobodianski, A., Schilling, A. F., Adamietz, P., Portner, R. Cartilage engineering from mesenchymal stem cells. Adv Biochem Eng Biotechnol. 123, 163-200 (2010).
  21. Ingber, D. E., et al. Tissue engineering and developmental biology: going biomimetic. Tissue Eng. 12 (12), 3265-3283 (2006).
  22. Yoshida, Y., Yamanaka, S. Recent stem cell advances: induced pluripotent stem cells for disease modeling and stem cell-based regeneration. Circulation. 122 (1), 80-87 (2010).

Play Video

Citar este artículo
Li, Y., Hai, Y., Chen, J., Liu, T. Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (125), e55722, doi:10.3791/55722 (2017).

View Video