Myc-induced T-cell Akut Lenfoblastik Lösemide Zebra bağıda Side Popülasyonunun İzolasyonu
Summary
Burada, myc-uyarılan T-hücreli akut lenfoblastik lösemi zebrabalıkları modelinde (T-ALL) yan nüfus hücreleri izole etmek için bir teknik açıklanmaktadır. Bu yan popülasyon deney yüksek oranda hassastır ve zebra balığı, T-ALL için tarif edilen, ancak diğer kötü huylu ve kötü huylu olmayan zebra balığı hücre tiplerine uygulanabilir.
Abstract
Hem sağlıklı hem de habis dokudan heterojen hücre popülasyonları, DNA bağlama boyası Hoechst 33342'yi dışarı atma yeteneği ile karakterize bir hücre popülasyonu içerebilir. Hücrelerin bu "yan popülasyonu", Hoechst 33342'den sonra akış sitometrik yöntemleri kullanılarak tanımlanabilir Boya ultraviyole (UV) lazerle uyarılır. Birçok hücre tipinin yan popülasyonu stem veya progenitor benzeri hücreler içerir. Bununla birlikte, tüm hücre tiplerinin tanımlanabilir yan popülasyonu yoktur. Danio rerio , zebrafish, T hücreli akut lenfoblastik löseminin (T-ALL) sağlam bir in vivo modeline sahip ancak bu zebra bağı T-ALL'lerin bir yan popülasyonu olup olmadığı bilinmiyor. Burada açıklanan yöntem, zebra balığı T-ALL'deki yan popülasyon hücrelerinin nasıl izole edilebileceğini açıklamaktadır. Başlamak için, zebra balığı içindeki T-ALL, tol2 plazmidlerinin bir hücre evresi embriyolarına mikroenjeksiyonu yoluyla üretilir. Tümörler aniden yarısından fazlasına genişlediği bir aşamaya geldiğindeMalın vücudu, T-ALL hücreleri hasat edilebilir. Hücreler daha sonra Hoechst 33342 ile lekelenir ve yan popülasyon hücreleri için akış sitometrisi ile muayene edilir. Bu yöntem, zebra balığı T-ALL araştırmasında geniş uygulamalara sahiptir. Zebra balığı içinde bu yan popülasyon hücrelerinin kanserli kök hücre benzeri olup olmadığını teyit eden bilinen bir hücre yüzeyi belirteçleri bulunmamakla birlikte, in vivo fonksiyonel transplantasyon testleri mümkündür. Ayrıca, bu yan popülasyon hücrelerinin genetik özelliklerini tanımlamak için tek hücreli transkriptomikler uygulanabilir.
Introduction
Yan nüfus tahlili hücre zarı ATP bağlayıcı kaset (ABC), taşıyıcı proteinler, yüksek düzeyde bir DNA bağlanma boya Hoechst 33342 akıttığı bir doku içinde belli hücrelerinin gelişmiş yetenek istifade. Hoechst 33342 boya dışa akımı, hücreler boya UV lazeri tarafından uyarılır sonra dual dalga boyu akış sitometrik analizi kullanılarak tespit edilebilir. Bu deney, ilk olarak fare hematopoietik kök hücreler (HSC), 1 tanımlamak için kullanılmıştır, ancak güne kadar bir çok doku ve kanser kök / progenitör hücre popülasyonlarının belirlenmesi için kullanılmıştır (referans 2 de incelenmiştir). Ancak, bütün hücre popülasyonları bir yan nüfusu ve tüm yan popülasyonları kök / progenitör hücreler açısından zenginleştirilmiş olan değil.
Zebra balığı, geleneksel fare mo üzerinde avantaj sayı ile insan kanseri 3, 4 çalışmak için güçlü bir omurgalı genetik model sistemKanserin DELS. Balığı embriyolar harici transgenesis ve kanser başlangıcında ve ilerlemesinde de dahil olmak üzere patolojik süreçlerin, in vivo gözlem kolaylaştıran döllenir ve optik açıdan berrak olan edilir. Bugüne kadar, yan nüfus tahlil potansiyel kök veya progenitör hücreler sadece HKH'lerin tespit etmek zebrabalıkları böbrek iliği uygulanır ve herhangi bir Zebra balığı kanser modelleri 5, 6 olmuştur algılamak için.
T-hücresi akut lenfoblastik lösemi zebra balığı modeli (T-ALL) morfolojik ve insan T-ALL 7, 8, 11 arasındaki genetik olarak benzer. T-ALL, insanlarda, pediatrik% 10-15'ini ve TÜM vakaların 9 yetişkin% 25'i oluşturuyor saldırgan kanseridir. T-ALL tedavisi geliştirilmiş olsa da, nüks hala yaygındır ve kötü prognoz ile ilişkilidir. T-ALL tümörler Heterojen olanLösemi başlatan hücreler (LIC'ler dahil olmak üzere birçok farklı tümör hücresi alt popülasyonu içerir. LIC'ler tek bir hücreden tüm tümörü yeniden başlatma kabiliyetleri ile tanımlanır ve bir tümör hücre popülasyonu içerisindeki LIC'lerin sıklığı, sınırlayıcı bir seyreltme transplantasyon testi (LDA) aracılığıyla çeşitli hücre dozlarını alıcılara naklederek hesaplanabilir. LICs 8 , 10 , 11 frekansını hesaplamak için zebrafish'de LDA deneyleri yapılırken, bu belirleme gezinme sırasında yapılır ve LIC'lerin prospektif izolasyonuna izin vermez. Bu nedenle, kanserli kök hücre aktivitesi için zenginleştirilmiş bir popülasyonu prospektif olarak izole etmek için bir yöntem bulunmamaktadır. Zebra balığı T-ALL'lerinden yan popülasyon hücrelerinin belirlenmesi ve izole edilmesi bu eksikliği gidermeye yönelik ilk adımdır.
Burada sunulan protokol, Zebr'de T-ALL tümörlerinin nasıl verimli bir şekilde üretileceğini açıklamaktadırafish tol2 aracılı transgenesis kullanan T-ALL tümörler hücreleri hasat ve hücrelerin yan popülasyonu tespit Hoechst 33342 ile boyanır. Zebra balığı, T-ALL in vivo deney gelecek yan popülasyonu, hücrelerin Lics için zenginleştirilmiş ya da diğer stem- veya projenitör benzeri özelliklere sahip olup olmadığı içerebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Yan popülasyon tahlili oldukça duyarlıdır; Bu nedenle, protokoldeki küçük değişiklikler, yan popülasyon hücrelerinin saptanmasında zorluklara neden olabilir. İlk olarak, boyama aşamasındaki sıcaklık, her bir hayvan / hücre sistemine özeldir. Memeli sistemleri için yan popülasyon tahlili tipik olarak 37 ° C'de yapılır. Zebra balığı T-ALL hücreleri 37 ° C'de inkübe edildiğinde, çoğu hücre öldü ve bu inkübasyon sıcaklığını kabul edilemez duruma getirdi (veriler gösterilmed…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Chicago Kadın Kurulu Üniversitesi Wendy Will Vaka Fonu ve Şikago Kapsamlı Kanser Merkezi Destek Hibe Üniversitesi (P30 CA014599) tarafından desteklenmiştir. Bu deneme oluşturmayla katkılarından dolayı Chicago Üniversitesi'nde Sitometrisi Core teşekkür etmek istiyorum ve iyi de Jong laboratuarında diğer üyeleri, özellikle Leslie Pedraza ve Sean McConnell olarak.
Materials
| Syngeneic zebrafish (CG2) | See Mizgireuv et al., 2006 | ||
| rag2:c-myc plasmid | Langenau Laboratory | ||
| rag2:GFP plasmid constructed in de Jong Lab | rag2 promoter from Langenau Laboratory | ||
| pCS2-transposase plasmid | Chien Laboratory | ||
| NotI -HF restriction enzyme | New England Bio-Labs Inc. | R3189S | 500 units in 25 µL |
| mMessage Machine SP6 Transcription Kit | Ambion | Thermo Fisher Scientific – AM1340 | 25 reactions |
| QIAGEN Plasmid Midi Kit | Qiagen, Inc. | 12643 | |
| SteREO Discovery V8 Microscope | Carl Zeiss Microscopy | 495015-0008-000 | |
| Digital microinjector | Tritech Research | MINJ-D | |
| Brass straight-arm needle holder | Tritech Research | MINJ-4 | |
| Magnetic base and stand | Tritech Research | MINJ-HBMB | |
| Micromanipulator | Narishige International | MN153 | |
| Glass capillaries | Sutter Instrument Co. | B100-50-10 | 10 cm without filament |
| Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf North America Inc. | 930001007 | |
| Phenol Red solution | Sigma Life Science | P0290 | 0.5% concentration 100 mL |
| Plastic Transfer pipettes | Fisherbrand | 137119D | graduated 7.5 mL bulb |
| Tricaine methanesulfonate (MS-222) | Western Chemical, Inc. | Fisher Scientific – NC0342409 | 100 g |
| Fetal bovine serum (FBS) | HyClone Laboratories, Inc. | Fisher Scientific – SH3007103 | 500 mL |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco by Life Technologies | 1001-023 | pH 7.4 (1x) – 500 mL |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | 2106 | 15 – 300 unit vials |
| 40 um mesh filter | Falcon Corning Brand | 352340 | Case of 50 |
| Trypan blue | Sigma Life Science | T8154 | 20 mL – Solution (0.4%) |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | 10 mL |
| Verapamil | Sigma Life Science | V4629 | 1 g |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Life Science | D8418 | 100 mL |
| Propidium Iodide | Life Technologies | P3566 | 10 mL |
| FACSAria Fusion cell sorter | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva 8.0.1 | BD Biosciences | ||
| FlowJo v10.2 | FlowJo, LLC |
Referencias
- Goodell, M., Brose, K., Paradis, G., Conner, A., Mulligan, R. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J. Exp. Med. 183, 1797-1806 (1996).
- Golebiewska, A., Brons, N. H. C., Bjerkvig, R., Niclou, S. Critical appraisal of the side population assay in stem cell and cancer stem cell research. Cell Stem Cell. 8, 136-147 (2011).
- Dooley, K., Zon, L. I. Zebrafish: a model system for the study of human disease. Curr Opin Genet Dev. 10 (3), 252-256 (2000).
- White, R., Rose, K., Zon, L. Zebrafish cancer: the state of the art and the path forward. Nat Rev Cancer. 13 (9), 624-636 (2013).
- Kobayashi, I., et al. Characterization and localization of side population (SP) cells in zebrafish kidney hematopoietic tissue. Blood. 111 (3), 1131-1137 (2008).
- Tsinkalovsky, O., Vik-Mo, A. O., Ferreira, S., Laerum, O. D., Fjose, A. Zebrafish kidney marrow contains ABCG2-dependent side population cells exhibiting hematopoietic stem cell properties. Differentiation. 75 (3), 175-183 (2007).
- Langenau, D. M., et al. Myc-induced T cell leukemia in transgenic zebrafish. Science. 299, 887-890 (2003).
- Blackburn, J. S., Liu, S., Langenau, D. M. Quantifying the frequency of tumor-propagating cells using limiting dilution cell transplantation in syngeneic zebrafish. J Vis Exp. , e2790 (2011).
- Martelli, A. M., et al. Targeting signaling pathways in T-cell acute lymphoblastic leukemia initiating cells. Adv Biol Regul. 56, 6-21 (2014).
- Smith, A. C. H., et al. High-throughput cell transplantation establishes that tumor-initiating cells are abundant in zebrafish T-cell acute lymphoblastic leukemia. Blood. 115 (16), 3296-3303 (2010).
- Blackburn, J. S., et al. Clonal evolution enhances leukemia-propagating cell frequency in T cell acute lymphoblastic leukemia through Akt/mTORC1 pathway activation. Cancer Cell. 25, 366-378 (2014).
- . Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Plasmid Purification. JoVE Science Education Database. , (2016).
- Kawakami, K. Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates. Genome Biol. 8, (2007).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
- Mizgireuv, I. V., Revskoy, S. Y. Transplantable tumor lines generated in clonal zebrafish. Investigación sobre el cáncer. 66 (6), 3120-3125 (2006).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish. , (1993).
- Hirschmann-Jax, C., et al. A distinct “side population” of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells. Proc Natl Acad Sci. USA. 101 (39), 14228-14233 (2004).
- Komuro, H., et al. Identification of side population cells (stem-like cell population) in pediatric solid tumor cell lines. J Pediatr Surg. 42 (12), 2040-2045 (2007).
- Moshaver, B., et al. Identification of a small subpopulation of candidate leukemia-initiating cells in the side population of patients with acute myeloid leukemia. Stem Cells. 26 (12), 3059-3067 (2008).
