Выделение Side населения в Myc-индуцированный Т-клеточный острый лимфобластный лейкоз в данио рерио
Summary
Здесь мы описываем методику выделения боковых популяционных клеток из модели данио-рыбки, индуцированной микозом острого лимфобластного лейкоза (T-ALL), вызванной myc. Этот популяционный анализ популяции очень чувствителен и описан для данио T-ALL, но он может быть применим и к другим злокачественным и злокачественным типам клеток данио.
Abstract
Гетерогенные клеточные популяции из здоровых или злокачественных тканей могут содержать популяцию клеток, характеризующуюся дифференциальной способностью к оттоку ДНК-связывающего красителя Hoechst 33342. Эту «боковую популяцию» клеток можно идентифицировать с использованием проточных цитометрических методов после Hoechst 33342 Краситель возбуждается ультрафиолетовым (УФ) лазером. Боковая популяция многих типов клеток содержит стволовые или подобные предшественникам клетки. Однако не все типы клеток имеют идентифицируемую боковую популяцию. Данио рерио , данио, имеет прочную in vivo модель Т-клеточного острого лимфобластного лейкоза (T-ALL), но есть ли у этих T-ALLs рыбок данио, боковая популяция неизвестна. Описанный здесь метод описывает, как выделить боковые популяционные клетки у рыбок данио T-ALL. Для начала, T-ALL у рыбок данио формируется посредством микроинъекции tol2-плазмид в одноклеточные стадии эмбрионов. Как только опухоли выросли до стадии, на которой они расширяются до более половинытело Мал, в клетки Т-ОЛЛ могут быть собраны. Клетки затем окрашивают Hoechst 33342 и исследовали с помощью проточной цитометрии для клеток со стороны населения. Этот метод имеет широкое применение в данио Т-ОЛЛ исследования. Хотя нет никаких известных маркеров клеточной поверхности в данио , которые подтверждают эти клетки со стороны населения , являются ли стволовые клетками рака, как в естественных условиях функциональной трансплантации анализы возможны. Кроме того, одноклеточная транскриптомика может быть применена для идентификации генетических особенностей этих клеток со стороны населения.
Introduction
Анализ популяции боковой популяции основан на усиленной способности некоторых клеток в ткани выводить ДНК-связывающий краситель Hoechst 33342 из-за высоких уровней транспортерных белков-переносчиков АТФ (АВС) на клеточной мембране. Клетки, которые выделяют краситель Hoechst 33342, могут быть идентифицированы с использованием двухволнового проточного цитометрического анализа после того, как краситель возбужден УФ-лазером. Этот анализ был впервые использован для идентификации мышиных гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) 1 , но с тех пор он использовался для идентификации популяций стволовых клеток / клеток-предшественников во многих тканях и раках (см. Ссылку 2). Однако не все популяции клеток имеют боковую популяцию, и не все боковые популяции обогащены клетками стволовых клеток-предшественников.
Данио является мощной генетической модельной системой позвоночных для изучения рака человека 3 , 4 , обладающей рядом преимуществ перед традиционным мышиным moРак. Зародыши данио рыбу внешне оплодотворяются и оптически прозрачны, что способствует трансгенезу и наблюдению in vivo патологических процессов, включая инициирование и прогрессирование рака. На сегодняшний день анализ боковой популяции для выявления потенциальных стволовых клеток или клеток-предшественников был применен только в почковом костном мозге у данио-данио для идентификации HSCs, а не для любых раковых моделей 5 , 6 данио.
Модель данио-острой Т-клеточной острой лимфобластной лейкемии (T-ALL) морфологически и генетически похожа на T-ALL 7 , 8 , 11 человека . T-ALL – агрессивное злокачественное заболевание, которое на людях составляет 10-15% педиатрических и 25% взрослых случаев ALL 9 . Хотя лечение T-ALL улучшилось, рецидив все еще распространен и связан с плохим прогнозом. Опухоли T-ALL гетерогенныеИ содержат много разных субпопуляций опухолевых клеток, включая лейкемические инициирующие клетки (LIC). LIC определяются их способностью восстанавливать всю опухоль из одной клетки, а частоту LIC в популяции опухолевых клеток можно рассчитать путем трансплантации различных доз клеток в реципиентов с помощью анализа трансплантации с предельным разбавлением (LDA). Хотя эксперименты LDA были проведены у рыбок данио для вычисления частоты LICs 8 , 10 , 11 , это определение сделано задним числом и не позволяет предполагаемую изоляцию LIC. Таким образом, отсутствует метод для потенциальной изоляции популяции, обогащенной активностью раковых стволовых клеток. Выявление и выделение боковых популяционных клеток из T-ALLs рыбок данио является первым шагом на пути устранения этого недостатка.
Представленный здесь протокол описывает, как эффективно генерировать опухоли T-ALL в zebrАфиши, используя tol2-опосредованный трансгенез, собирают клетки опухолей T-ALL и окрашивают их Hoechst 33342 для идентификации боковой популяции клеток. Будущие эксперименты in vivo с данио-рыбой T-ALL могут включать в себя, обогащены ли боковые популяционные клетки для LIC или имеют другие свойства, подобные стволовым или предшественникам.
Protocol
Representative Results
Discussion
Анализ стороны населения обладает высокой чувствительностью; Таким образом, небольшие изменения в протокол могут привести к трудности в обнаружении клеток со стороны населения. Во-первых, температура во время стадии окрашивания является специфическим для каждой системы животных / кл…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана в Университете Чикаго Совета женщин, дело фонд Венди Уилла, и Университет Чикаго Comprehensive Cancer Center поддержка Гранта (P30 CA014599). Мы хотели бы поблагодарить проточной цитометрии Сердечник в Университете Чикаго за помощь в создании этого эксперимента, а также других членов лаборатории де Йонг, в частности, Лесли Педрасы и Шон Макконнелл.
Materials
| Syngeneic zebrafish (CG2) | See Mizgireuv et al., 2006 | ||
| rag2:c-myc plasmid | Langenau Laboratory | ||
| rag2:GFP plasmid constructed in de Jong Lab | rag2 promoter from Langenau Laboratory | ||
| pCS2-transposase plasmid | Chien Laboratory | ||
| NotI -HF restriction enzyme | New England Bio-Labs Inc. | R3189S | 500 units in 25 µL |
| mMessage Machine SP6 Transcription Kit | Ambion | Thermo Fisher Scientific – AM1340 | 25 reactions |
| QIAGEN Plasmid Midi Kit | Qiagen, Inc. | 12643 | |
| SteREO Discovery V8 Microscope | Carl Zeiss Microscopy | 495015-0008-000 | |
| Digital microinjector | Tritech Research | MINJ-D | |
| Brass straight-arm needle holder | Tritech Research | MINJ-4 | |
| Magnetic base and stand | Tritech Research | MINJ-HBMB | |
| Micromanipulator | Narishige International | MN153 | |
| Glass capillaries | Sutter Instrument Co. | B100-50-10 | 10 cm without filament |
| Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf North America Inc. | 930001007 | |
| Phenol Red solution | Sigma Life Science | P0290 | 0.5% concentration 100 mL |
| Plastic Transfer pipettes | Fisherbrand | 137119D | graduated 7.5 mL bulb |
| Tricaine methanesulfonate (MS-222) | Western Chemical, Inc. | Fisher Scientific – NC0342409 | 100 g |
| Fetal bovine serum (FBS) | HyClone Laboratories, Inc. | Fisher Scientific – SH3007103 | 500 mL |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco by Life Technologies | 1001-023 | pH 7.4 (1x) – 500 mL |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | 2106 | 15 – 300 unit vials |
| 40 um mesh filter | Falcon Corning Brand | 352340 | Case of 50 |
| Trypan blue | Sigma Life Science | T8154 | 20 mL – Solution (0.4%) |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | 10 mL |
| Verapamil | Sigma Life Science | V4629 | 1 g |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Life Science | D8418 | 100 mL |
| Propidium Iodide | Life Technologies | P3566 | 10 mL |
| FACSAria Fusion cell sorter | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva 8.0.1 | BD Biosciences | ||
| FlowJo v10.2 | FlowJo, LLC |
Referencias
- Goodell, M., Brose, K., Paradis, G., Conner, A., Mulligan, R. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J. Exp. Med. 183, 1797-1806 (1996).
- Golebiewska, A., Brons, N. H. C., Bjerkvig, R., Niclou, S. Critical appraisal of the side population assay in stem cell and cancer stem cell research. Cell Stem Cell. 8, 136-147 (2011).
- Dooley, K., Zon, L. I. Zebrafish: a model system for the study of human disease. Curr Opin Genet Dev. 10 (3), 252-256 (2000).
- White, R., Rose, K., Zon, L. Zebrafish cancer: the state of the art and the path forward. Nat Rev Cancer. 13 (9), 624-636 (2013).
- Kobayashi, I., et al. Characterization and localization of side population (SP) cells in zebrafish kidney hematopoietic tissue. Blood. 111 (3), 1131-1137 (2008).
- Tsinkalovsky, O., Vik-Mo, A. O., Ferreira, S., Laerum, O. D., Fjose, A. Zebrafish kidney marrow contains ABCG2-dependent side population cells exhibiting hematopoietic stem cell properties. Differentiation. 75 (3), 175-183 (2007).
- Langenau, D. M., et al. Myc-induced T cell leukemia in transgenic zebrafish. Science. 299, 887-890 (2003).
- Blackburn, J. S., Liu, S., Langenau, D. M. Quantifying the frequency of tumor-propagating cells using limiting dilution cell transplantation in syngeneic zebrafish. J Vis Exp. , e2790 (2011).
- Martelli, A. M., et al. Targeting signaling pathways in T-cell acute lymphoblastic leukemia initiating cells. Adv Biol Regul. 56, 6-21 (2014).
- Smith, A. C. H., et al. High-throughput cell transplantation establishes that tumor-initiating cells are abundant in zebrafish T-cell acute lymphoblastic leukemia. Blood. 115 (16), 3296-3303 (2010).
- Blackburn, J. S., et al. Clonal evolution enhances leukemia-propagating cell frequency in T cell acute lymphoblastic leukemia through Akt/mTORC1 pathway activation. Cancer Cell. 25, 366-378 (2014).
- . Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Plasmid Purification. JoVE Science Education Database. , (2016).
- Kawakami, K. Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates. Genome Biol. 8, (2007).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
- Mizgireuv, I. V., Revskoy, S. Y. Transplantable tumor lines generated in clonal zebrafish. Investigación sobre el cáncer. 66 (6), 3120-3125 (2006).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish. , (1993).
- Hirschmann-Jax, C., et al. A distinct “side population” of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells. Proc Natl Acad Sci. USA. 101 (39), 14228-14233 (2004).
- Komuro, H., et al. Identification of side population cells (stem-like cell population) in pediatric solid tumor cell lines. J Pediatr Surg. 42 (12), 2040-2045 (2007).
- Moshaver, B., et al. Identification of a small subpopulation of candidate leukemia-initiating cells in the side population of patients with acute myeloid leukemia. Stem Cells. 26 (12), 3059-3067 (2008).
