Isolamento della popolazione Side di Myc-indotta delle cellule T leucemia linfoblastica acuta in Zebrafish
Summary
Qui, descriviamo una tecnica per isolare le cellule popolazione lato da un modello zebrafish di cellule T myc indotta da leucemia linfoblastica acuta (T-ALL). Questo saggio popolazione lato è altamente sensibile ed è descritta per zebrafish T-ALL, ma può essere applicabile ad altri tipi di cellule zebrafish maligne e non maligne.
Abstract
popolazioni cellulari eterogenee, da entrambi i tessuti sani o maligni, possono contenere una popolazione di cellule caratterizzati da una diversa capacità di efflusso del colorante DNA-binding Hoechst 33342. Questa "side population" di cellule possono essere identificate usando i metodi di citometria a flusso dopo la Hoechst 33342 colorante viene eccitato da un (UV) laser ultravioletto. La popolazione collaterale di molti tipi di cellule contiene cellule progenitrici stem- o simile. Tuttavia, non tutti i tipi di cellule hanno una popolazione lato identificabile. Danio rerio, zebrafish, hanno un robusto modello in vivo di cellule T leucemia linfoblastica acuta (T-ALL), ma se questi zebrafish T-alls hanno una popolazione lato è sconosciuto. Il metodo descritto qui delinea come isolare le cellule popolazione lato in zebrafish T-ALL. Per cominciare, il T-ALL in zebrafish viene generato tramite la microiniezione di plasmidi tol2 in embrioni stadio di una cellula. Una volta che i tumori sono cresciuti ad uno stadio in cui si espandono in più della metà del aniIl corpo di Mal, le cellule T-ALL può essere raccolto. Le cellule vengono poi colorate con Hoechst 33342 ed esaminati mediante citometria di flusso per celle popolazione lato. Questo metodo ha vaste applicazioni in zebrafish T-ALL ricerca. Mentre non ci sono noti marcatori di superficie delle cellule in zebrafish che confermano se queste cellule popolazione lato sono cellule simil-staminali del cancro, in vivo test di trapianto funzionali sono possibili. Inoltre, trascrittomica monocellulari potrebbero essere applicati per identificare le caratteristiche genetiche di queste cellule popolazione lato.
Introduction
Il test di popolazione laterale capitalizza sulla capacità aumentata di alcune cellule all'interno di un tessuto per scaricare il colorante vincolante del DNA Hoechst 33342 a causa di elevati livelli di proteine transporter di cassetta (ATP) leganti per le membrane cellulari. Le cellule che effluxano il colorante Hoechst 33342 possono essere identificate usando doppia analisi citometrica a flusso di lunghezza d'onda dopo che il colorante viene eccitato da un laser UV. Questo saggio è stato usato per identificare le cellule staminali ematopoietiche murine (HSCs) 1 , ma da allora è stato utilizzato per identificare le popolazioni di cellule staminali / progenitori in molti tessuti e tumori (esaminati nel riferimento 2). Tuttavia, non tutte le popolazioni di cellule hanno una popolazione laterale e non tutte le popolazioni laterali sono arricchite per le cellule staminali / progenitori.
Il pesce zebra è un potente sistema di modelli genetici vertebrati per studiare il cancro umano 3 , 4 , con un certo numero di vantaggi rispetto al tradizionale models di cancro. Zebrafish embrioni sono fecondati esternamente e sono otticamente trasparente, facilitando transgenesi e l'osservazione in vivo dei processi patologici, tra iniziazione e progressione del cancro. Fino ad oggi, il saggio della popolazione lato per rilevare potenziali cellule staminali o progenitrici è stata applicata soltanto fino al midollo rene in zebrafish per identificare HSC, e non a qualsiasi modelli di cancro zebrafish 5, 6.
Il modello zebrafish di T-cell leucemia linfoblastica acuta (T-ALL) è morfologicamente e geneticamente simile a umano T-ALL 7, 8, 11. T-ALL è un tumore maligno aggressivo che, negli esseri umani, rappresenta il 10-15% dei pediatrica e il 25% di tutti i casi di adulti 9. Mentre il trattamento di T-ALL è migliorata, la ricaduta è ancora comune ed è associata ad una prognosi sfavorevole. T-TUTTI I tumori sono hétérogèneE contengono molte diverse sottopopolazioni di cellule tumorali, incluse le cellule di innesco delle leucemie (LICs). I LICs sono definiti dalla loro capacità di ricreare l'intero tumore da una singola cellula e la frequenza dei LIC all'interno di una popolazione di cellule tumorali può essere calcolata trapiantando dosi cellulari variabili nei destinatari tramite un limite di trapianto di diluizione (LDA). Mentre gli esperimenti LDA sono stati eseguiti in zebrafish per calcolare la frequenza dei LICs 8 , 10 , 11 , questa determinazione viene effettuata in retrospettiva e non consente l'isolamento prospettico di LICs. Pertanto, manca un metodo per isolare prospetticamente una popolazione arricchita per l'attività delle cellule staminali del cancro. Identificare e isolare le cellule di popolazione laterali da zebrafish T-ALLs è il primo passo verso l'affrontare questa carenza.
Il protocollo qui descritto descrive come generare in modo efficiente tumori T-ALL in zebrAffish utilizzando transgenesis tol2-mediata, raccogliere le cellule tumorali T-ALL e colorarle con Hoechst 33342 per identificare la popolazione laterale delle cellule. I futuri esperimenti in vivo con zebrafish T-ALL potrebbero includere se le cellule di popolazione laterali sono arricchite per LIC o hanno altre proprietà stem- o progenitrici.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il saggio popolazione lato è molto sensibile; pertanto, piccole modifiche al protocollo può comportare una difficoltà di individuare cellule popolazione lato. In primo luogo, la temperatura durante la fase di colorazione specifica per ogni sistema animale / cellule. Per i sistemi di mammifero, il saggio popolazione lato viene tipicamente eseguita a 37 ° C 2. Quando il T-ALL cellule zebrafish sono state incubate a 37 ° C, molte delle cellule morti, che ha reso questa temperatura di incubazion…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal Board of Women's University of Chicago, dal Wendy Will Case Fund e dall'Università di Chicago nel complesso del Cancer Center Grant (P30 CA014599). Vorremmo ringraziare il Core Flow Cytometry presso l'Università di Chicago per il loro aiuto nella creazione di questo esperimento, e come altri membri del laboratorio de Jong, in particolare Leslie Pedraza e Sean McConnell.
Materials
| Syngeneic zebrafish (CG2) | See Mizgireuv et al., 2006 | ||
| rag2:c-myc plasmid | Langenau Laboratory | ||
| rag2:GFP plasmid constructed in de Jong Lab | rag2 promoter from Langenau Laboratory | ||
| pCS2-transposase plasmid | Chien Laboratory | ||
| NotI -HF restriction enzyme | New England Bio-Labs Inc. | R3189S | 500 units in 25 µL |
| mMessage Machine SP6 Transcription Kit | Ambion | Thermo Fisher Scientific – AM1340 | 25 reactions |
| QIAGEN Plasmid Midi Kit | Qiagen, Inc. | 12643 | |
| SteREO Discovery V8 Microscope | Carl Zeiss Microscopy | 495015-0008-000 | |
| Digital microinjector | Tritech Research | MINJ-D | |
| Brass straight-arm needle holder | Tritech Research | MINJ-4 | |
| Magnetic base and stand | Tritech Research | MINJ-HBMB | |
| Micromanipulator | Narishige International | MN153 | |
| Glass capillaries | Sutter Instrument Co. | B100-50-10 | 10 cm without filament |
| Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf North America Inc. | 930001007 | |
| Phenol Red solution | Sigma Life Science | P0290 | 0.5% concentration 100 mL |
| Plastic Transfer pipettes | Fisherbrand | 137119D | graduated 7.5 mL bulb |
| Tricaine methanesulfonate (MS-222) | Western Chemical, Inc. | Fisher Scientific – NC0342409 | 100 g |
| Fetal bovine serum (FBS) | HyClone Laboratories, Inc. | Fisher Scientific – SH3007103 | 500 mL |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco by Life Technologies | 1001-023 | pH 7.4 (1x) – 500 mL |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | 2106 | 15 – 300 unit vials |
| 40 um mesh filter | Falcon Corning Brand | 352340 | Case of 50 |
| Trypan blue | Sigma Life Science | T8154 | 20 mL – Solution (0.4%) |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | 10 mL |
| Verapamil | Sigma Life Science | V4629 | 1 g |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Life Science | D8418 | 100 mL |
| Propidium Iodide | Life Technologies | P3566 | 10 mL |
| FACSAria Fusion cell sorter | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva 8.0.1 | BD Biosciences | ||
| FlowJo v10.2 | FlowJo, LLC |
Referencias
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