L'isolement de la population latérale dans la leucémie lymphoblastique aiguë de cellules T induite par Myc dans le poisson zèbre
Summary
Nous décrivons ici une technique pour isoler les cellules de la population de côté d'un modèle de poisson zèbre leucémie aiguë lymphoblastique T myc induite (T-ALL). Ce test de population côté est très sensible et est décrit pour T-ALL zebrafish, mais il peut être applicable à d'autres types de cellules malignes et non zebrafish malignes.
Abstract
Les populations de cellules hétérogènes, à partir de tissus sains ou malins, peuvent contenir une population de cellules caractérisées par une capacité différentielle à effacer le colorant de liaison à l'ADN Hoechst 33342. Cette «population latérale» des cellules peut être identifiée à l'aide de méthodes cytométriques en flux après le Hoechst 33342 Le colorant est excité par un laser ultraviolet (UV). La population secondaire de nombreux types de cellules contient des cellules souches ou de type progéniteur. Cependant, tous les types de cellules n'ont pas une population latérale identifiable. Danio rerio , le poisson zèbre, possèdent un modèle robuste in vivo de leucémie lymphoblastique aiguë des lymphocytes T (T-ALL), mais on ignore si ces T-ALL de poisson zèbre ont une population latérale. La méthode décrite ici décrit comment isoler les cellules latérales de la population dans le T-ALL du poisson zèbre. Pour commencer, le T-ALL dans le poisson zèbre est généré par micro-injection de plasmides tol2 dans des embryons à une seule cellule. Une fois que les tumeurs sont passées à une étape où elles se développent dans plus de la moitié de l'aniMal, les cellules T-ALL peuvent être récoltées. Les cellules sont ensuite colorées avec Hoechst 33342 et examinées par cytométrie en flux pour les cellules de population latérales. Cette méthode a de larges applications dans la recherche T-ALL de poisson zèbre. Bien qu'il n'y ait pas de marqueurs de surface cellulaire connus dans le poisson zèbre qui confirment si ces cellules de population latérale sont des cellules cancéreuses, des tests de transplantation fonctionnelle in vivo sont possibles. De plus, une transcriptomie à une seule cellule pourrait être utilisée pour identifier les caractéristiques génétiques de ces cellules latérales.
Introduction
Le dosage de la population latérale met en majuscule la capacité améliorée de certaines cellules dans un tissu à efflux du colorant de liaison à l'ADN Hoechst 33342 en raison des niveaux élevés de protéines transportrices de la cassette de liaison ATP (ABC) sur la membrane cellulaire. Les cellules qui effluxent le colorant Hoechst 33342 peuvent être identifiées à l'aide d'une analyse cytométrique à double flux de longueur d'onde après que le colorant soit excité par un laser UV. Ce test a d'abord été utilisé pour identifier les cellules souches hématopoïétiques murines (HSC) 1 , mais il a depuis été utilisé pour identifier les populations de cellules souches / progénitrices dans de nombreux tissus et cancers (révisé dans la référence 2). Cependant, toutes les populations de cellules n'ont pas une population latérale, et toutes les populations latérales ne sont pas enrichies pour les cellules souches / progénitrices.
Le poisson zèbre est un puissant système de modèle génétique de vertébrés pour étudier le cancer humain 3 , 4 , avec un certain nombre d'avantages par rapport au mo murin traditionneldels de cancer. Embryons de poisson zèbre sont fertilisés à l' extérieur et sont optiquement clair, ce qui facilite la transgénèse et l'observation in vivo de processus pathologiques, y compris l' initiation et la progression du cancer. À ce jour, le dosage de la population de côté pour détecter souches potentielles ou les cellules progénitrices n'a été appliquée à la moelle du rein chez le poisson zèbre pour identifier CSHs, et non à tous les modèles de cancer 5, 6 poisson zèbre.
Le modèle zebrafish de leucémie lymphoblastique aiguë à cellules T (T-ALL) est morphologiquement et génétiquement similaires à T-ALL 7, 8 humaine, 11. T-ALL est une tumeur maligne agressive qui, chez l' homme, représente 10-15% de pédiatrie et 25% des adultes TOUS les cas 9. Bien que le traitement des T-ALL est améliorée, la rechute est encore courante et est associée à un mauvais pronostic. T-ALL tumeurs sont HeterogeneEt qui contiennent de nombreuses sous-populations de cellules tumorales, y compris les cellules initiatrices de leucémies (LIC). Les LIC sont définis par leur capacité à repousser la totalité de la tumeur à partir d'une cellule unique, et la fréquence des LIC dans une population de cellules tumorales peut être calculée en transplanant des doses cellulaires variables en récipients via un dosage de transposition de dilution limite (LDA). Alors que les expériences de LDA ont été effectuées dans le poisson zèbre pour calculer la fréquence des LIC 8 , 10 , 11 , cette détermination est faite en rétrospective et ne permet pas l'isolement prospectif des LIC. Par conséquent, une méthode pour isoler prospectivement une population enrichie pour l'activité des cellules souches cancéreuses est insuffisante. L'identification et l'isolement des cellules de population latérales des T-ALL de poissons zèbres est la première étape vers la résolution de cette carence.
Le protocole présenté ici décrit comment générer efficacement des tumeurs T-ALL dans zebrafish utilisant la transgénèse médiée par TOL2, récolter les cellules T-ALL tumeurs, et de les colorer avec Hoechst 33342 pour identifier la population de côté de cellules. Avenir dans des expériences in vivo avec T-ALL zebrafish pourrait comprendre si les cellules de la population de côté sont enrichis pour les PFR ou ont d' autres propriétés ou comme tige – progénitrices.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le dosage de population latérale est très sensible; Par conséquent, de petites modifications apportées au protocole peuvent entraîner une difficulté à détecter les cellules de population latérales. Tout d'abord, la température pendant l'étape de coloration est spécifique à chaque système animal / cellulaire. Pour les systèmes de mammifères, le dosage de la population latérale est généralement effectué à 37 ° C 2 . Lorsque les cellules T-ALL de poisson zèbre ont ét?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par l'Université de Chicago Board de femmes, Wendy financerons cas, et l'Université de Chicago Comprehensive Cancer Center de soutien de subvention (CA014599 P30). Nous tenons à remercier le flux Cytométrie de base à l'Université de Chicago pour leur aide dans la mise en place de cette expérience, et ainsi que d'autres membres du laboratoire de Jong, en particulier Leslie Pedraza et Sean McConnell.
Materials
| Syngeneic zebrafish (CG2) | See Mizgireuv et al., 2006 | ||
| rag2:c-myc plasmid | Langenau Laboratory | ||
| rag2:GFP plasmid constructed in de Jong Lab | rag2 promoter from Langenau Laboratory | ||
| pCS2-transposase plasmid | Chien Laboratory | ||
| NotI -HF restriction enzyme | New England Bio-Labs Inc. | R3189S | 500 units in 25 µL |
| mMessage Machine SP6 Transcription Kit | Ambion | Thermo Fisher Scientific – AM1340 | 25 reactions |
| QIAGEN Plasmid Midi Kit | Qiagen, Inc. | 12643 | |
| SteREO Discovery V8 Microscope | Carl Zeiss Microscopy | 495015-0008-000 | |
| Digital microinjector | Tritech Research | MINJ-D | |
| Brass straight-arm needle holder | Tritech Research | MINJ-4 | |
| Magnetic base and stand | Tritech Research | MINJ-HBMB | |
| Micromanipulator | Narishige International | MN153 | |
| Glass capillaries | Sutter Instrument Co. | B100-50-10 | 10 cm without filament |
| Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf North America Inc. | 930001007 | |
| Phenol Red solution | Sigma Life Science | P0290 | 0.5% concentration 100 mL |
| Plastic Transfer pipettes | Fisherbrand | 137119D | graduated 7.5 mL bulb |
| Tricaine methanesulfonate (MS-222) | Western Chemical, Inc. | Fisher Scientific – NC0342409 | 100 g |
| Fetal bovine serum (FBS) | HyClone Laboratories, Inc. | Fisher Scientific – SH3007103 | 500 mL |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco by Life Technologies | 1001-023 | pH 7.4 (1x) – 500 mL |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | 2106 | 15 – 300 unit vials |
| 40 um mesh filter | Falcon Corning Brand | 352340 | Case of 50 |
| Trypan blue | Sigma Life Science | T8154 | 20 mL – Solution (0.4%) |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | 10 mL |
| Verapamil | Sigma Life Science | V4629 | 1 g |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Life Science | D8418 | 100 mL |
| Propidium Iodide | Life Technologies | P3566 | 10 mL |
| FACSAria Fusion cell sorter | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva 8.0.1 | BD Biosciences | ||
| FlowJo v10.2 | FlowJo, LLC |
Referencias
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