Fosforilasyon Saha Tespiti İçin Oligopeptide Rekabet Testi
Summary
Peptid rekabet testleri, çeşitli moleküler ve immünolojik deneylerde yaygın olarak kullanılır. Bu makale , in vitro oligopeptitle rekabet eden kinaz testi için ayrıntılı bir yöntem ve ilgili fosforilasyon sitelerini bulmak için yararlı olabilen ilişkili validasyon prosedürlerini açıklamaktadır.
Abstract
Belirli bölgelerdeki protein fosforilasyonu, konformasyonunu ve diğer moleküllerle olan etkileşimini belirler. Böylece protein fosforilasyonu, hücrenin biyolojik işlevlerini ve özelliklerini etkiler. Günümüzde, fosforilasyon alanlarını keşfetmek için en yaygın yöntem, hızlı ve hassas bir yöntem olan sıvı kromatografi / kütle spektrometresi (LC / MS) analizidir. Bununla birlikte, nispeten kararsız fosfat kısımları sıklıkla sahte-negatif sinyaller üreten parçalanma aşaması esnasında fosfopeptidlerden salınmaktadır. Bu gibi durumlarda , bölgeye yönelik mutantları kullanan geleneksel bir in vitro kinaz tahlili daha doğru olur, ancak bu yöntem zahmetli ve zaman alıcıdır. Bu nedenle, peptid rekabetini kullanan alternatif bir yöntem avantajlı olabilir. 5 'adenosin monofosfat aktive protein kinaz (AMPK)' nın konsensüs tanıma motifi 1 olarak belirlenmiş ve pozisyonel tarama peptit kütüphanesi eşeği kullanılarak onaylanmıştır2. ay. Böylece, yeni bir substrat için AMPK fosforilasyon bölgeleri peptid rekabet deneyleri ile öngörülebilir ve teyit edilebilir. Bu raporda, AMPK aracılı nükleer faktör eritroid 2 ile ilişkili faktör 2 (Nrf2) fosforilasyonunu örnekleyerek, in vitro oligopeptidle rekabet eden kinaz tahlili için ayrıntılı adımları ve prosedürleri açıklıyoruz. Fosforilasyon sahasının kimliğini doğrulamak için, bir bölgeye özgü mutant kullanarak ardışık in vitro kinaz deneyi gerçekleştirdik. Genel olarak, peptit rekabet tahlili, çoklu potansiyel fosforilasyon bölgelerini taramak ve fosforilasyon bölgesi mutantları tarafından geçerlilik için siteleri belirlemek için bir yöntem sağlar.
Introduction
Belirli bir tortuda protein fosforilasyonu çok çeşitli hücresel süreçlerde önemli bir rol oynamaktadır. Bu nedenle, sinyalleme ağlarının anlaşılması, spesifik fosforilasyon sahalarının tanımlanmasını gerektirir. Buna ek olarak, fosforilasyon bölgesi protein işlevindeki etkiyi belirler, çünkü bir proteindeki tekli alanlar farklı yapılara ve işlevlere sahiptir. Anahtar bir antioksidan transkripsiyon faktörü olan nükleer faktör eritroid 2-ilişkili faktör 2 (Nrf2) aktivitesi, farklı bölgelerdeki fosforilasyon yoluyla iki yönlü olarak düzenlenir. Çalışmalarımız, Nrf2'nin fosforilasyonunu katalizleyen kinazlara odaklanmıştır. Nrf2'nin oksidatif meydan okumaya karşı stres tepkisi, esas olarak serin 40'da fosforilasyon yoluyla ve Nrf2 3 , 4'ü aktive eden protein kinaz C (PKC) -8 aracılığında hızlı bir şekilde oluşur. Tersine, Fyn, Tirozin 5'de Nrf2'nin inhibe edici fosforilasyonunu katalize ederAktivitenin sıkı kontrolü için 68.
Fosforilasyon bölgelerini keşfetmek için kullanılan en yaygın yöntem sıvı kromatografisi / kütle spektrometresi (LC / MS) analizidir. Hızlı ve son derece hassas fosforilasyon sitesi haritalama verileri bu şekilde oluşturulabilir; Bununla birlikte, sıklıkla yanlış negatif sinyaller üreten birkaç teknik sınırlama vardır. Zayıf dizi kapsamı sıklıkla LC / MS analizinde meydana gelir. Fosforilasyon bölgelerini belirlemek için, bir proteinin maksimum amino asit kapsamı hakkında bilgi gereklidir 6 . Sindirim basamağı boyunca ilgi çekici proteinin birkaç proteazla proteolizi, sekans kapsamının iyileştirilmesinde yardımcı olabilir. Fosforilasyon kalıntılarının belirlenmesinin bir başka engeli, serin ve treonin fosforile peptitler 6 , 7 için sıklıkla gözlemlenen kolay fosforik asit kaybıdır. Labil fosfat kısımları genellikleParçalanma işlemi sırasında fosfopeptidlerden salınır 7 . Fosforilasyon bölgeleri ararken ikinci seçenek, bir peptid mikrodizisi metodu kullanmaktadır. İlgi konusu bir proteinden türetilen peptid fragmanlarını içeren bir mikro-dizi çipi kullanarak kinaz hedef bölgeleri için tarama yapmak mümkündür. Bununla birlikte, mikroarray çipinin üretilmesi ve algılanması için ekipman gereksinimi nedeniyle, peptid mikrodizisi metodu zaman alıcı ve pahalıdır.
Bu zorlukların üstesinden gelmek için, bilinen tanıma motifleri olan bir protein kinazı için bir in vitro oligopeptit-rekabet kinaz testi kullanılabilir. Bir kinazın konsensüs tanıma motifi oluşturulursa, aday bir substratın varsayılan fosforilasyon bölgeleri tahmin edilebilir ve sitelerin orijinalliği doğrulanabilir. Bu işlem için en ikna edici yöntem, bir mutant proteinde fosforilasyonun kaldırılmasını göstermektir; burada predicteD kalıntısı, fosforile edilemeyen bir amino asitle ( yani, alanin için serin ya da treonin, tirosinden fenilalanine) ikame edilir. Bununla birlikte, mutant proteinlerin üretimi ve izolasyonu zaman alıcıdır. Araştırmanın ilk aşamasında alternatif olarak, rekabetçi peptit kinaz tahlili basit ve kullanışlıdır. Burada, bir in vitro peptit rekabet testi için ve fosforilasyon bölgesinin doğrulamasına ilişkin bir protokolü açıklıyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
AMPK'nın aracılık ettiği tahmini fosforilasyon mevkilerinin özgünlüğünü değerlendirmenin basit ve kullanışlı bir yolu olarak, burada, rekabetçi peptidleri kullanarak belirli bir fosforilasyon bölgesini keşfetmek ve bir bölgeye özgü mutant kullanarak doğrulamak için kullanılabilecek bir in vitro kinaz tahlilini açıklamaktayız . In vitro rekabetçi AMPK aktivite tahlilinden elde edilen temsili veriler, bir bölgeye yönlendirilmiş mutant protein kullanılarak bir deneyin so…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Kore Ulusal Hükümet Başkanlığı (MSIP) tarafından finanse edilen Kore Ulusal Araştırma Vakfı (2015R1A2A1A10052663 ve 2014M1A3A3A02034698 no'lu) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| HEPES | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 15630 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 208337 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | E3889 | |
| DTT | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | D9779 | |
| β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G9422 | |
| Na3VO4 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 450243 | |
| Protease inhibitor cocktail | Calbiochem, Nottingham, UK | 539134 | |
| ATP | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A2383 | |
| AMP | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A1752 | |
| AMPK | Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY | 14-840 | |
| Nrf2 (WT) | Abnova, Taipei City, Taiwan | H00004780-P01 | |
| [γ-32P]-ATP | PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Waltham, MA | NEG502A | |
| EZblue staining reagent | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G1041 | |
| Pfu turbo DNA polymerase | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | 600250 | |
| dNTP mix | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | 200415-51 | Avoid multiple thaw and freezing cycle |
| DpnI | New England Biolabs, Ipswich, MA | R0176S | |
| LB broth | Duchefa Biochemie BV, Haarlem, Netherlands | L1704 | |
| Ampicillin | Affymetrix, Santa Clara, CA | 11259 | |
| Agarose LE | iNtRON Biotechnology, Sungnam, South Korea | 32034 | |
| HiYield Plus Gel/PCR DNA Mini Kit | Real Biotech Corporation, Taipei, Taiwan | QDF100 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 161-0400 | |
| Bovine Serum Albumin | Bovogen Biologicals, Victoria, Australia | BSA100 | |
| Glutathione Sepharose 4B | GE Healthcare, Marlborough, MA | 17-0756-01 | |
| Acetic Acid glacial | Duksan pure chemicals, Ansan, South Korea | ||
| Methyl alcohol | Daejung Chemicals & Metals, Siheung, South Korea | 5558-4410 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Typhoon FLA 7000 | GE Healthcare, Marlborough, MA | 28-9558-09 | |
| SDS-PAGE kit | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 1658001FC | |
| Vacuum pump | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 165-178 | |
| Gel dryer | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 165-1746 | |
| Dancing shaker | FINEPCR, Seoul, Korea | CR300 | The machine is needed for washing step |
| PCR machine | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | T100 | |
| Incubator/shakers | N-BIOTEK, GyeongGi-Do, Korea | NB-205L | |
| Microcentrifuges | LABOGENE, Seoul, Korea | 1730R | |
| Chromatography columns | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 732-1010 |
Referencias
- Hardie, D. G., Schaffer, B. E., Brunet, A. AMPK: An energy-sensing pathway with multiple inputs and outputs. Trends Cell Biol. 26, 190-201 (2016).
- Gwinn, D. M., et al. AMPK phosphorylation of raptor mediates a metabolic checkpoint. Mol Cell. 30, 214-226 (2008).
- Huang, H. C., Nguyen, T., Pickett, C. B. Phosphorylation of Nrf2 at Ser-40 by protein kinase C regulates antioxidant response element-mediated transcription. J Biol Chem. 277, 42769-42774 (2002).
- Niture, S. K., Jain, A. K., Jaiswal, A. K. Antioxidant-induced modification of INrf2 cysteine 151 and PKC-delta-mediated phosphorylation of Nrf2 serine 40 are both required for stabilization and nuclear translocation of Nrf2 and increased drug resistance. J Cell Sci. 122, 4452-4464 (2009).
- Jain, A. K., Jaiswal, A. K. GSK-3beta acts upstream of Fyn kinase in regulation of nuclear export and degradation of NF-E2 related factor 2. J Biol Chem. 282, 16502-16510 (2007).
- Steen, H., Jebanathirajah, J. A., Rush, J., Morrice, N., Kirschner, M. W. Phosphorylation analysis by mass spectrometry: myths, facts, and the consequences for qualitative and quantitative measurements. Mol Cell Proteomics. 5, 172-181 (2006).
- Dephoure, N., Gould, K. L., Gygi, S. P., Kellogg, D. R. Mapping and analysis of phosphorylation sites: a quick guide for cell biologists. Mol Biol Cell. 24, 535-542 (2013).
- Joo, M. S., et al. AMPK facilitates nuclear accumulation of Nrf2 by phosphorylating at Serine 550. Mol Cell Biol. 36, 1931-1942 (2016).
- Sinclair, W. K., Holloway, A. F. Half-lives of some radioactive isotopes. Nature. 167 (4244), 365 (1951).
- Chang, B. Y., Chiang, M., Cartwright, C. A. The interaction of Src and RACK1 is enhanced by activation of protein kinase C and tyrosine phosphorylation of RACK1. J Biol Chem. 276, 20346-20356 (2001).
- Smith, L., et al. RACK1 interacts with filamin-A to regulate plasma membrane levels of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Am J Physiol Cell Physiol. 305 (1), C111-C120 (2013).
