मस्तिष्क झिल्ली फलन: एक<em> पूर्व विवो</em> सबसिनेप्टिक प्रोटीन स्थानीयकरण का आकलन करने के लिए दृष्टिकोण
Summary
यहां, हम मस्तिष्क झिल्ली विभाजन प्रोटोकॉल पेश करते हैं जो अलग-अलग अन्तर्ग्रथनी डिब्बों से संबंधित प्रोटीन को अलग करने के लिए एक मजबूत प्रक्रिया का प्रतिनिधित्व करता है।
Abstract
अन्तर्ग्रथनी प्रोटीन संरचना और समारोह का मूल्यांकन तंत्रिका विज्ञान में एक महत्वपूर्ण चुनौती है। हालांकि, synapses के भीतर होता है कि neurotransmission का मूल्यांकन करना आसान नहीं है क्योंकि यह गतिशील प्रोटीन प्रोटीन बातचीत और phosphorylation घटनाओं द्वारा अत्यधिक विनियमित है। तदनुसार, जब कोई भी तरीका अन्तर्ग्रथनी संचरण का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है, तो एक प्रमुख लक्ष्य इन क्षणिक शारीरिक संशोधनों को संरक्षित करना है। यहां, हम मस्तिष्क झिल्ली विभाजन प्रोटोकॉल पेश करते हैं जो अलग-अलग अन्तर्ग्रथनी डिब्बों से संबंधित प्रोटीन को अलग करने के लिए एक मजबूत प्रक्रिया का प्रतिनिधित्व करता है। दूसरे शब्दों में, प्रोटोकॉल एक बायोकेमिकल पद्धति का वर्णन करता है जो प्रोसेन प्रोटीन संवर्धन को पूर्वसंयोजिक, पोस्टसीनैप्टिक, और एक्स्ट्रासिनैप्टीक डिब्बों से ले जाने के लिए किया जाता है। सबसे पहले, सिनाप्टोसोम, या सिन्नेप्टिक टर्मिनल, न्यूरॉन्स से प्राप्त होते हैं जिसमें एक अनियंत्रित सूक्रोज़ ग्रेडिएंट के माध्यम से सभी अन्तर्ग्रथनी डिपार्टमेंट होते हैं। नोट, इस प्रारंभिक अन्तर्ग्रथनी झिल्ली की तैयारी की गुणवत्ता c हैritical। इसके पश्चात, विभेदक पीएच स्थितियों में हल्के डिटर्जेंट का उपयोग करते हुए प्रकाश सोल्यूबिलाइजेशन के साथ अलग-अलग सबसिनेप्टिक डिब्बों का अलगाव प्राप्त किया जाता है। यह ढाल और आइओपीकनिक सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा अलग होने की अनुमति देता है। अंत में, विभिन्न subsynaptic डिब्बों में प्रोटीन संवर्धन ( यानी, प्री-, पोस्ट- और एक्स्ट्रासिनेप्टिक मेम्ब्रेन फ्रैक्शंस) को अच्छी तरह से वर्णित अन्तर्ग्रथनी प्रोटीन मार्करों ( अर्थात एसएएनएपी -25, PSD-95, और सिनाइप्टोफिज़िन का उपयोग करके immunoblot विश्लेषण के माध्यम से मान्य किया गया है, क्रमशः), इस प्रकार किसी भी विशेष न्यूरॉनल प्रोटीन के अन्तर्ग्रथनी वितरण के प्रत्यक्ष मूल्यांकन को सक्षम किया जा सकता है।
Introduction
सिनैप्टिक ट्रांसमिशन संकुचन की भौतिक अखंडता पर निर्भर करता है, एक अवधारणा जिसे फोस्टर और शेरिंग्टन 1 द्वारा 18 9 7 के रूप में शुरू किया गया था। इस प्रकार, सामान्य न्यूरोट्रांसमिशन घटकों ( उदा। आयन चैनल, रिसेप्टर्स इत्यादि ) के वितरण को समझना आवश्यक है, सामान्य और रोग दोनों में दोनों ही अन्तर्ग्रथनी कार्यों को स्पष्ट करना है। इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम) ने प्रोटोटाइपिकल सेंट्रल नर्वस सिस्टम (सीएनएस) सिंकैप्स की वर्तमान मूल संरचनात्मक धारणा को अत्यधिक योगदान दिया है। इस तरह, ईएम ने पूर्व- और पोस्ट-एन्टेप्टिक घनत्वों के बीच अंतर को स्थापित किया है, जो एक समान समान दूरी (~ 25 एनएम) 2 से अलग हो जाते हैं । दिलचस्प बात यह है कि पोस्टअन्तैप्टीक तंत्र अपने प्लाज्मा झिल्ली के नीचे एक अपेक्षाकृत निरंतर, इलेक्ट्रॉन-घने मोटाई दर्शाता है, तथाकथित पोस्टअन्सेप्टिक घनत्व या PSD 2 । इसके विपरीत, presynaptic उपकरण पर, एक नोटिसई असंतत साइटमैट्रिक्स नेटवर्क प्लाज्मा प्लाज्मा के नीचे ही व्यवस्थित किया जाता है, जो प्लाज्मा झिल्ली सक्रिय क्षेत्र 3 को संरेखित फैट के संरेखण और डॉकिंग के लिए आवश्यक है। इसलिए, ईएम संरचनात्मक रूप से संरक्षित सीएनएस संक्रमणों के भीतर प्रोटीन के वितरण का सर्वेक्षण करने के लिए सुनहरे प्रायोगिक दृष्टिकोण का गठन करता है। हालांकि, इलेक्ट्रोन माइक्रोग्राफ द्वारा प्रदान की गई जानकारी स्थिर है। दरअसल, साक्ष्य जमा करने से पता चलता है कि विवो में संक्रमण बहुत ही गतिशील है, इस प्रकार निरंतर अन्तर्ग्रथनी संचरण पर नाटकीय संरचनात्मक परिवर्तन का सामना करना पड़ रहा है। इसके अलावा, शल्यक्रिया का आकारिकी और संरचना विभिन्न सीएनएस क्षेत्रों में और विकास, परिपक्वता, बुढ़ापे, और न्यूरोपैथोलॉजिकल परिस्थितियों के विकास पर बदल सकते हैं। कुल मिलाकर, एक प्रोटोकॉल ने शारीरिक स्थितियों में अलग-अलग अन्तर्ग्रथनी डिब्बों से संबंधित प्रोटीन को अलग करने पर ध्यान केंद्रित किया, सिनाप्टिक कार्य के अधिक व्यापक अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है।
<p class = "jove_content"> यहां, हम इस तरह के पूरक प्रायोगिक दृष्टिकोण का वर्णन करते हैं, जो अलग-अलग अन्तर्ग्रथनी झिल्ली के डिब्बों के प्रारंभिक जैव रासायनिक संवर्धन के लिए अनुमति देता है- अर्थात्, अतिरिक्त-, पूर्व- और पोस्ट-एन्टेप्टिक झिल्ली डोमेन। यह झिल्ली विभाजन प्रणाली, पहले फिलिप्स एट द्वारा वर्णित है (2001) 4 , एक पीएच बदलाव पर आधारित है जो पूर्व और पोस्टअन्तैप्टीक उपकरण के भीतर होने वाली चिपकने वाली बातचीत को कमजोर करता है। सबसे पहले, पीएएच 6.0 पर हल्के डिटर्जेंट का इस्तेमाल करके, अनुयायियों के जंक्शन पर विचार करना संभव है जो प्री- और पोस्ट-एन्टेप्टिक उपकरण रखता है और जिसे एक्सट्रांससिनेटिक झिल्ली डोमेन से बनाए रखा जाता है, जिसे सुलझाया जाता है और इस तरह से अन्तर्ग्रथनी संपर्कों से निकाला जा सकता है। इसके बाद, हल्के डिटर्जेंट की उपस्थिति में पीएच को 6.0 से बढ़ाकर 8.0 करने के लिए अनुयायी जंक्शन की ताकत कमजोर होती है जो presynaptic सक्रिय क्षेत्र को स्थिर रूप से पोस्टअन्नेप्टिक घनत्व तक सीमित रखती है। इसलिए, प्रीस्कैनेप्टिक डिब्बे ऐसा हैलिब्बिलाइज्ड और पोस्टअन्नेप्टिक घनत्व से अलग किया जा सकता है, जो ज्यादातर संरक्षित है क्योंकि डिटर्जेंट का एकाग्रता अपने solubilization को बढ़ावा नहीं देता 4 । दिलचस्प बात यह है कि विभेदक दक्षता, अंततः 90% से अधिक, अलग-अलग subsynaptic मार्करों द्वारा पुष्टि की जा सकती है: i ) प्रोसाइनैप्टिक सक्रिय क्षेत्र से, synaptosomal-associated protein 25 (SNAP-25); Ii ) एक्स्ट्रासिन्टेप्टिक अंश से ( यानी, सक्रिय क्षेत्र के बाहर और माइक्रोस्कोम सहित) synaptophysin; और iii ) पोस्टअन्नेप्टिक घनत्व प्रोटीन 95 (PSD-95), पोस्टअन्नेप्टैप्टिक घनत्व से। विशेष रूप से, इस मस्तिष्क झिल्ली विभाजन विधि को सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है तदनुसार, अलग-अलग रिसेप्टरों जैसे अल्फा-एमिनो-3-हाइड्रोक्सी-5-मिथाइल -4-आयोक्सीज़ोलप्रोपोनिक एसिड (एएमपीए) रिसेप्टर्स 5 , एडेनोसिन ए 1 रिसेप्टर (ए 1 आर) 6 , एसिनासिन ए 1 रिसेप्टर (ए 1 आर 6 ,एडेनोसिन ए 2 ए रिसेप्टर (ए 2 ए आर 7 ), एडेनोसिन ट्राइफॉस्फेट (एटीपी) पी 2 रिसेप्टर्स 8 , निकोटीनिक एसिटाइलकोलाइन रिसेप्टर सब्यूनिट्स 9 , और पार्किंसंस रोग से जुड़े रिसेप्टर जीपीआर 37 10 । हालांकि, कई सीमाएं एक विशेष न्यूरोनल प्रोटीन के अन्तर्ग्रथनी वितरण के उचित आकलन में बाधा डाल सकती हैं। इस प्रकार, इस प्रक्रिया में, हम संपूर्ण प्रोटोकॉल का पूरी तरह से वर्णन नहीं करते हैं, लेकिन हम कुछ महत्वपूर्ण बिंदुओं को भी उजागर करते हैं, जैसे कि बड़ी मात्रा में ऊतक की जरूरत है, कम प्रोटीन उपज और अनिवार्य आवश्यकता की दक्षता को मान्य करने के लिए निश्चित प्रयोग करने से पहले प्रत्येक जुदाईProtocol
Representative Results
Discussion
The protocol presented here constitutes a powerful biochemical tool for the study of the subsynaptic distribution of specific proteins within any brain region. However, there are some drawbacks inherent to the technique that deserve to be highlighted here. For instance, one of the main limitations is the relatively large amount of tissue needed to purify a reasonable amount of protein in order to perform the immunoblot analysis of all subsynaptic fractions. This issue might be related to the fact that synapses (i.e.,…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को मंत्रीओ की अर्थव्यवस्था द्वारा समर्थित किया गया था / प्रतियोगितात्मक / इंस्टीटुटो डी सलाद कार्लोस III (एसएएफ2014-55700-पी, पीसीआईएन -013-019-सी 0 3-03 और पीआईई 14/00034), इंस्टीट्यूसी कोटालाना डी रिकेरका इस्टिडिस एवनकाट्स (आईसीआरएए अकादमी -2010) ), और एग्जेसचैप के लिए इनोवेटी डोर व्हाट्सचैप एन टेक्नोलॉजी (एसबीओ -140028) एफसी से, एक्स एम, वीएफ-डी, और एफसी "न्यूरोफर्माकोलॉजी और दर्द" मान्यता प्राप्त शोध समूह (जनरलटैट डी कातालुन्या, 2014 एसजीआर 1251) से संबंधित हैं। । सीएपीईएस (ब्राज़ील) से एफसी तक "कामकाजी पस्केविदॉर डेवेलटेन्ट एक्स्पल-सिनेसिस सेम फ्रोंटेइरास" का भी समर्थन किया गया था
Materials
| Sucrose | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,316,211,211 | |
| CaCl2 | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 2,112,211,210 | |
| MgCl2·6H2O | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,313,961,210 | |
| Protease inhibitor cocktail Set III | Millipore, Darmstadt, Germany | 535140 | |
| Trizma Base | Sigma, St. Louis, MO, USA | T1503 | |
| Tris-HCl | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,236,541,209 | |
| Triton X-100 | Sigma, St. Louis, MO, USA | X100 | |
| SDS | Sigma, St. Louis, MO, USA | L3771 | |
| Glycerol | Sigma, St. Louis, MO, USA | G5516 | |
| Bromophenol Blue | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,311,651,604 | |
| Dithiothreitol | Sigma, St. Louis, MO, USA | D0632 | |
| Tween 20 | Sigma, St. Louis, MO, USA | P2287 | |
| Non fat dry milk | |||
| NaCl | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,216,591,211 | |
| KCl | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,314,941,210 | |
| KH2PO4 | Merck | 4873 | |
| Na2HPO4 | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,316,781,211 | |
| Basic 20 pH | Crison, Alella, Spain | ||
| Polytron VDI 12 Adaptable Homogenizer | VWR, Radnor, PA, USA. | ||
| Ultra-Clear Tubes (14x89mm) | Beckman Coulter, Hospitalet de Llobregat, Barcelona | 344059 | Tubes should be filled almost completely when used to prevent collapsing due to ultracentrifugation. |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal filters Ultracel -10K | Merck Millipore, Darmstadt, Germany | UFC901008 | |
| Centrifuge 5430R | Eppendorf, Hamburgo, Germany | ||
| Optima L-90K Ultracentrifuge | Beckman Coulter, Hospitalet de Llobregat, Barcelona | ||
| Sonifier 250 | Branson, Danbury, Connecticut | ||
| Amersham Imager 600 | GE Healthcare Europe GmbH, Barcelona, Spain | ||
| Disposable Glass Pasteur Pippetes 230 mm | VWR, Radnor, PA, USA | 612-1702 | |
| Compact Balance EK-610 | A&D, Tokyo, Japan | ||
| Pierce™ BCA Protein Assay Kit | Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA | ||
| SuperSignal west pico chemiluminescent substrate | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | ||
| GR 200 Precision Balance | A&D, Tokyo, Japan | ||
| Anti-GPR37 | Homemade antibody anti-GPR37 produced and validated in Francisco Ciruela Laboratory. | Primary antibodies used at a final concentration of 0.250ug/ml | |
| Anti-SNAP-25, anti-PSD-95, anti-synaptophysin | Abcam, Cambridge, United Kingdom | Primary antibodies diluted 1:10000 | |
| HRP-conjugated goat anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA. | Secondary antibody diluted 1:10000 | |
| HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA. | Secondary antibody diluted 1:30000 |
Referencias
- Foster, M., Sherrington, C. S. Part III: The Central Nervous System. A Text Book of Physiology. , (1897).
- Peters, A., Palay, S. L., Webster, H. D. F. . The fine structure of the nervous system. , (1991).
- Harris, K. M., Weinberg, R. J. Ultrastructure of Synapses in the Mammalian Brain. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4, 005587-005587 (2012).
- Phillips, G. R., et al. The presynaptic particle web: ultrastructure, composition, dissolution, and reconstitution. Neuron. 32, 63-77 (2001).
- Pinheiro, P. S., et al. Solubilization and immunological identification of presynaptic alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid receptors in the rat hippocampus. Neurosci. Lett. 336, 97-100 (2003).
- Rebola, N., Pinheiro, P. C., Oliveira, C. R., Malva, J. O., Cunha, R. A. Subcellular localization of adenosine A(1) receptors in nerve terminals and synapses of the rat hippocampus. Brain Res. 987, 49-58 (2003).
- Rebola, N., Canas, P. M., Oliveira, C. R., Cunha, R. A. Different synaptic and subsynaptic localization of adenosine A2A receptors in the hippocampus and striatum of the rat. Neurociencias. 132, 893-903 (2005).
- Rodrigues, R. J. Dual Presynaptic Control by ATP of Glutamate Release via Facilitatory P2X1, P2X2/3, and P2X3 and Inhibitory P2Y1, P2Y2, and/or P2Y4 Receptors in the Rat. J. Neurosci. 25, 6286-6295 (2005).
- Garção, P., Oliveira, C. R., Cunha, R. A., Agostinho, P. Subsynaptic localization of nicotinic acetylcholine receptor subunits: a comparative study in the mouse and rat striatum. Neurosci. Lett. 566, 106-110 (2014).
- Lopes, J. P., et al. The role of parkinson’s disease-associated receptor GPR37 in the hippocampus: functional interplay with the adenosinergic system. J. Neurochem. 134, 135-146 (2015).
- Clark, J. D., Gebhart, G. F., Gonder, J. C., Keeling, M. E., Kohn, D. F. Special Report: The 1996 Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. ILAR J. 38, 41-48 (1997).
- Rusakov, D. A., Harrison, E., Stewart, M. G. Synapses in hippocampus occupy only 1-2% of cell membranes and are spaced less than half-micron apart: a quantitative ultrastructural analysis with discussion of physiological implications. Neuropharmacology. 37, 513-521 (1998).
- Zeng, Z., Su, K., Kyaw, H., Li, Y. A novel endothelin receptor type-B-like gene enriched in the brain. Biochem. Biophys. Res. Commun. 233, 559-567 (1997).
- Bodenmuller, H., Schilling, E., Zachmann, B., Schaller, H. C. The neuropeptide head activator loses its biological acitivity by dimerization. EMBO J. 5, 1825-1829 (1986).
- Rezgaoui, M., et al. The neuropeptide head activator is a high-affinity ligand for the orphan G-protein-coupled receptor GPR37. J. Cell Sci. 119, 542-549 (2006).
- Gandìa, J., Fernández-Dueñas, V., et al. The Parkinson’s disease-associated GPR37 receptor-mediated cytotoxicity is controlled by its intracellular cysteine-rich domain. J. Neurochem. 125, 362-372 (2013).
- Meyer, R. C., Giddens, M. M., Schaefer, S. A., Hall, R. A. GPR37 and GPR37L1 are receptors for the neuroprotective and glioprotective factors prosaptide and prosaposin. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 9529-9534 (2013).
- Takahashi, R., Imai, Y. Pael receptor, endoplasmic reticulum stress, and Parkinson’s disease. J. Neurol. 250, 9 (2003).
