Isolatie van intermediaire filamentproteïnen uit meerdere muisweefsels om te bestuderen veroudering-geassocieerde post-translationele modificaties

IF's zijn een familie van eiwitten die bij mensen worden gecodeerd door 73 genen en zijn ingedeeld in zes hoofdvormen: typen I-IV zijn cytoplasmatisch ( bijv. Epitheliale en haarkeratinen (K), myocyt desmin, neurofilamenten, glialfibrillair zuur eiwit (GFAP), en anderen); Type V zijn de kernlamellen; En type VI zijn IF's in de ooglens ¹ . In termen van hun moleculaire organisatie hebben IF-eiwitten drie gemeenschappelijke domeinen: een hoogwaardig geconsolideerd "spiraal" -domein, en bolvormige "hoofd- en" staartdomeinen. Als eiwittetrameren elkaar samenvoegen om korte filamentprecursoren te vormen, die uiteindelijk worden opgenomen in volwassen filamenten die dynamische cytoskeletale en nucleoskeletale structuren vormen die betrokken zijn bij mechanische bescherming ² , stresswaarneming ^{3 , 4} , regulatie van transcriptie ⁵ en groei en andere kritische cellulaire functies"> 1 ^{, 6 , 7} .

Het functionele belang van het IF-systeem wordt gemarkeerd door het bestaan ​​van vele menselijke ziekten veroorzaakt door missense-mutaties in IF-genen, waaronder neuropathieën, myopathieën, huidverstoringsstoornissen, metabolische disfuncties en vroegtijdige verouderende syndromen ⁸ . Sommige IF-genmutaties veroorzaken niet, maar veronderstellen hun dragers op ziekteprogressie, zoals de eenvoudige epitheliale keratinen bij de leverziekte ⁹ . Deze laatste is te danken aan de kritische stress-beschermende functies van IF's in epithelia. IF's in het algemeen behoren tot de meest voorkomende cellulaire eiwitten onder basale condities, maar worden verder sterk geïnduceerd tijdens verschillende soorten stress ¹⁰ . Bijvoorbeeld, recente studies die de eiwitbreedse veranderingen in de nematode C. elegans hebben aangetoond, aangetoond dat meerdere IF's sterk geherreguleerd en gevoelig zijn voor aggregatieAan tijdens organismeveroudering ^{11 , 12} . Aangezien het behoud van een juiste IF-structuur essentieel is voor cellulaire resistentie tegen verschillende vormen van stress ¹⁰ , kan IF aggregatie ook bijdragen aan de functionele daling tijdens veroudering. Echter, organismen op het niveau van studies die meerdere zoogdier IF-eiwitten onderzoeken over verschillende weefsels die stress ondervinden, ontbreken.

IF's zijn zeer dynamische structuren die zich aanpassen aan mobiele eisen. Keratinen ondergaan bijvoorbeeld een biosynthese-onafhankelijke cyclus tussen oplosbaar (niet-filamente) en onoplosbaar (filamentvormig) eiwitpool ¹³ . Bij normale fysiologische omstandigheden kan ongeveer 5% het totale K8 / K18-pool worden geëxtraheerd in detergentvrije buffer, in vergelijking met ongeveer 20% die kan worden opgelost in het nonionische wasmiddel Nonidet P-40, dat biochemisch vergelijkbaar is met Triton- X100 ^{14 ,} </sUp> ¹⁵ . Tijdens mitose is er een opmerkelijke toename van de oplosbaarheid van enkel-type epitheel K8 en K1814, die minder zichtbaar is in epidermale keratinen, maar meer duidelijk in vimentine en andere type III IF-eiwitten ^{15 , 16} . Oplosbaarheidseigenschappen van IF-eiwitten worden strikt gereguleerd door fosforylering, een sleutel post-translationele modificatie (PTM) voor filamentherrangschikking en oplosbaarheid ^{17 , 18 , 19 , 20} . De meeste IF's ondergaan uitgebreide regelgeving door een aantal PTM's op geconserveerde locaties, wat resulteert in functionele veranderingen ¹⁷ .

Het doel van deze methode is om onderzoekers te introduceren die nieuw zijn op het IF-gebied naar biochemische extractie en analytische methoden voor de studie van IF-eiwitten over meerdere muisweefsels. SpecifiekBondgenoot, concentreren we ons op isolatie van IF-eiwitten door gebruik te maken van een extractiemethode met hoge zout en beoordeling van veranderingen in PTM's via massaspectrometrie en door PTM-targetende antilichamen. Deze werkwijzen zijn gebaseerd op eerder gepubliceerde procedures ^21, maar omvatten wijzigingen voor het extraheren van verschillende IF-eiwitsoorten om gemeenschappelijk mechanisme voor regulering over de IF-familie te ontdekken. Bijvoorbeeld reguleert K8-acetylering bij een specifiek lysine-residu filamentorganisatie, terwijl hyperacetylatie K8-onoplosbaarheid en aggregaatvorming ²² bevordert. Recent recente wereldwijde proteomische profileringsstudies hebben bovendien aangetoond dat de meeste weefselspecifieke IF-eiwitten ook doelstellingen voor acetylering zijn en dat de meeste IF-acetyleringsplaatsen beperkt zijn tot het sterk geconserveerde staafdomein. Dit wijst op de noodzaak van methoden die geschikt zijn voor wereldwijde profilering van het IF-systeem. We introduceren ook een snelle methode om IF-eiwitten van meerdere weefsels te isoleren met behulp van geautomatiseerde homogenisatie in optiGematiseerde lysingsmatrix. De resulterende preparaten zijn geschikt voor stroomafwaartse PTM analyse via massaspectrometrie en andere methoden.