胚胎血管生成的可视化和定量分析<em>热带非洲爪蟾</em
Summary
该方案证明了一种基于荧光的方法来显示脉管系统并量化其在热带非洲爪蟾中的复杂性 。在遗传和/或药理学操作之后，将荧光染料注射到胚胎的跳动心脏中以在体内研究心血管发育后几分钟可以对血管进行成像。
Abstract
血管在全身供给氧气和营养物质，血管网络的形成受到严格的发展控制。血管的有效体内可视化及其复杂性的可靠定量是了解血管网络的生物学和疾病的关键。在这里，我们提供了一个详细的方法，用市售的荧光染料，人血浆乙酰化低密度脂蛋白DiI复合物（DiI-AcLDL）可视化血管，并量化他们在热带非洲爪蟾的复杂性 。可以通过将DiI-AcLDL简单注入胚胎的跳动心脏来标记血管，并且在整个胚胎中的血管可以在活的或固定的胚胎中成像。通过靶向显微注射核酸和/或药理试剂的浴液应用基因扰动，基因或信号传导途径对血管发育的作用可以揭示在一个星期内不参与复杂的遗传工程动物。由于非洲爪蟾定义良好的静脉系统及其刻板血管生成，预先存在的血管发芽，血管复杂性可以在扰动实验后有效量化。这个相对简单的协议应该作为心血管研究领域的一个易于访问的工具。
Introduction
血管生成，从新出生的内皮细胞形成新血管，血管发生，从先前存在的血管形成新血管，是形成胚胎脉管系统的两个不同的过程。这些过程中的任何调节都会导致各种心脏疾病和血管的结构异常。此外，肿瘤生长与不受控制的血管生长有关。因此，血管发生和血管生成的分子机制是密切研究的对象2 。
非洲爪蟾和斑马鱼是有吸引力的脊椎动物模型，用于血管发生和血管生成研究，原因有几个。首先，他们的胚胎很小;因此，对整个脉管系统进行成像是比较容易的。其次，胚胎发育很快;整个脉管系统只需要几天的时间才能发展，在此期间，发展中的血管可以成像。第三，容器形成之前和期间的遗传和药物干预是容易进行的，例如通过将反义吗啉代核苷酸（MO）显微注射到发育中的胚胎中或通过药物3,4,5的浴中应用。
非洲爪蟾对斑马鱼的独特优势是可以进行胚胎操作，因为非洲爪蟾遵循定型的全息切割，胚胎命运图很好地定义6 。例如，可以通过在两细胞阶段向一个细胞注射反义MO来产生仅遗传操纵一个侧面的胚胎。还可以将心原子从一个胚胎移植到另一个胚胎，以确定该基因是否通过细胞内在或外在机制发挥其功能ass =“xref”> 7。虽然这些技术主要是在非洲爪蟾属中开发的，它是异源四倍体，因此不适用于遗传研究，但它们可以直接应用于热带非洲爪蟾 ，这是一种密切相关的二倍体物种。
在活非洲爪蟾胚胎中可视化脉管系统的一种方法是注射荧光染料以标记血管。用荧光分子如DiI标记的乙酰化低密度脂蛋白（AcLDL）是非常有用的探针。与未乙酰化LDL不同，AcLDL不与LDL受体9结合，但被巨噬细胞和内皮细胞吞噬。将DiI-AcLDL注射到活体动物的心脏中导致内皮细胞的特异性荧光标记，并且可以通过荧光显微镜在活的或固定的胚胎中成像整个脉管系统。
在这里，我们在非洲爪蟾中使用DiI-AcLDL进行血管显像和定量的详细方案（ 图1 ）。我们提供了关键的实践要点，例如成功和不成功的实验。此外，我们提供了一种用于定量分析血管复杂性的直接方法，可用于评估遗传和环境因素对血管网络形成的影响。
Protocol
Representative Results
Discussion
这里提出的方案首先由Ali H.Brivanlou及其同事开发，以调查非洲爪蟾 4的血管形成过程中的发育事件，但如本手稿所示，可用于其他小动物。将染料注入心脏很容易进行，整个血管网络可以在荧光解剖显微镜下以及共聚焦显微镜下成像。如果染料在血管发育过程中注入心脏，血管生长和分支的动力学可以实时成像4 。使用明确定义的静脉网络，特别是PCV和最…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项研究的灵感来自Levine等人的工作。描述了这一实验方法，并提供了非洲爪蟾血管发育的综合描述。我们感谢我们实验室的成员的投入。本研究得益于延世大学未来领先的2015年研究计划（2015年至22年）和国家科研基金会（NRF）的生物和医学技术开发计划（NRF），由科学，ICT与未来计划部NRF-2013M3A9D5072551）
Materials
| 35mm Petri dish | SPL | 10035 | Sylgard mold frame |
| 60mm Petri dish | SPL | 10060 | Embryo raising tray |
| Borosilicate Glass | Sutter instrument | B100-50-10 | Needle for injection |
| BSA | Sigma | A3059-10G | Coating reagent |
| CaCl2 | D.S.P.GR Reagent | 0.1X MBS component | |
| Coverslip | Superior | HSU-0111520 | For confocal imaging |
| DiI-AcLDL | Thermo Fisher Scientific | L3484 | Vessel staining solution |
| FBS | Hyclone | SH.30919.02 | For storage of testis |
| Fiber Optical Illuminator | World Precision Instruments | Z-LITE-Z | Light |
| Ficoll | Sigma | F4375 | Injection buffer |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter instrument | P-97 | Injection needle puller |
| Forcep | Fine Science Tool | 11255-20 | For embryo hatching and needle tip cutting |
| Glass Bottom dish | SPL | 100350 | For confocal imaging |
| hCG | MNS Korea | For priming of frogs | |
| HEPES | Sigma | H3375 | Buffering agent |
| Incubator | Lab. Companion | ILP-02 | For raising embryos |
| KCl | DAEJUNG | 6566-4400 | MBS component |
| L15 medium | Gibco | 11415-114 | For storage of testis |
| L-cysteine | Sigma | 168149-100G | De-jellying reagent |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | MBS component |
| Microtube | Axygen | MCT-175-C-S | For storage of testis |
| MS222 | Sigma | E10521 | Anesthetic powder |
| NaCl | DAEJUNG | 7647-14-5 | MBS component |
| NaOH | Sigma | S-0899 | pH adjusting reagent |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Fixatives |
| PBS | BIOSESANG | P2007 | Buffer for imaging |
| pH paper | Sigma | P4536-100EA | For confirming pH |
| PICO-LITER INJECTOR | Waner instruments | PLI-100A | For injection |
| Pin | Pinservice | 26002-10 | For incision |
| Pinholder | Scitech Korea | 26016-12 | For incision |
| Precision Stereo Zoom Binocular Microscope | World Precision Instruments | PZMIII | For visual screening |
| Standard Manual Control Micromanipulator | Waner instruments | W4 64-0056 | For microinjection |
| SYLGARD 184 Kit | Dow Corning | For DiI injection | |
| Transfer pipette | Korea Ace Scientific Co. | YM.B78-400 | For eggs and embryo collection |
Referencias
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