Aislamiento gotas de lípidos para el análisis cuantitativo de Espectrometría de Masas

Gotitas de lípidos son altamente orgánulos celulares citoplasmáticos (y nucleares) dinámicas compuestas de un núcleo de lípidos neutros (triglicéridos (TG) y de éster de colesterol (CE)) cerrado por una monocapa de fosfolípidos con proteínas incrustadas ^1. Todos los tipos de células producen gotitas de lípidos, pero que varían en tamaño, composición lipídica, y la decoración de la proteína. gotitas de lípidos cumplen diversas funciones, incluyendo servir como depósitos de energía y precursores de membrana o como depósitos de proteínas. Además, a través de la absorción de lípidos, que protegen las células de la lipotoxicidad, lípidos de liberación como moléculas de señalización, y están involucrados en la degradación de proteínas y las respuestas al estrés de retículo endoplásmico (ER) ^2. Como tal, una gran cantidad de proteínas se unen a las gotas de lípidos y gobernar su generación, la degradación, la trata, y la interacción con otros organelos. Entre ellos se encuentran la familia de proteínas de unión perilipina gotas de lípidos de buena fe (PLIN1-5)f "> 3.

Lipid gotita biogénesis probable comienza en el ER, donde las enzimas ER-residente catalizan la síntesis de lípidos neutros que se acumulan dentro de la bicapa de la membrana, formando una lente de lípidos neutros, un proceso que recientemente se visualizó muy bien en la levadura ^4. Membrana de flexión y los niveles elevados de ácido y diacilglicerol fosfatídicos son entonces pensaron para atraer a las proteínas implicadas en la biosíntesis de fosfolípidos, como la síntesis simultánea de los lípidos neutros de núcleo y los fosfolípidos de blindaje que se requiere para la generación de gotas de lípidos ^5. Las enzimas que albergan dominios transmembrana que residen en el ER catalizan este proceso. Expansión a grandes gotas de lípidos requiere la actividad de una clase diferente de enzimas lípidos sintetizar que albergan una hélice anfipática y por lo tanto puede viajar desde el ER a gotitas de lípidos. La movilización de lípidos de gotitas de lípidos se produce a través de la activación local del triglicéridoE y diacilglicerol lipasa lipasas adiposo triglicéridos (ATGL) y lipasa sensible a hormonas (HSL) o por diferentes vías autofágicas, tales como macro- y microlipophagy o autofagia ⁶ chaperona-mediadas. Gotitas de lípidos interactúan con otros orgánulos celulares, tales como las mitocondrias (por beta-oxidación y la síntesis de lípidos) y ER (para la síntesis de lípidos y el tráfico de proteínas), pero también con los lisosomas, endosomas, y las vacuolas inducidos por bacterias intracelulares ^7. De hecho bacterias, virus, e incluso parásitos diana gotitas de lípidos para la replicación y la persistencia, entre ellos HCV ^8.

Infección por el VHC es una de las principales causas de morbilidad relacionada con el hígado y mortalidad en todo el mundo, lo que representa aproximadamente 0,5 millones de muertes al año ^9. El número real de infecciones por VHC es desconocida, pero las estimaciones recientes sugieren que 130 – 150 millones de personas están infectadas crónicamente. sin vaccine existe, pero los antivirales de acción directa-aprobados recientemente aumentar de forma espectacular las respuestas terapéuticas en comparación con la terapia estándar con interferón. Sin embargo, en todo el mundo, el tratamiento de los pacientes probablemente será restringido debido a los costos extremadamente altos de las nuevas terapias. Alrededor de la mitad de todos los individuos infectados crónicamente con VHC desarrollan enfermedad de hígado graso (esteatosis), una condición caracterizada por la acumulación excesiva de gotitas de lípidos en los hepatocitos. Curiosamente, gotitas de lípidos también surgieron orgánulos celulares como vitales para la replicación del VHC, que sirve putativamente como sitios de ensamblaje viral ^{10, 11.}

En las células infectadas con el VHC, el núcleo de la proteína viral y NS5A localizar a gotitas de lípidos en un proceso que depende de la biosíntesis de triglicéridos, como inhibidores de la diacilglicerol aciltransferasa-1 (DGAT1) poner en peligro el tráfico a gotas de lípidos y producción de partículas posterior HCV ¹² </sup^{>, 13, 14, 15.} Además, las mutaciones en los dominios de unión de gotitas de lípidos de cualquiera de núcleo o NS5A suprimen ensamblaje del VHC ^{16, 17.} Core y NS5A reclutan entonces todas las otras proteínas virales, así como los complejos de replicación de ARN viral, a las membranas estrechamente asociados con lípidos gotitas ^16. Se requiere una acción concertada de todas las proteínas virales para la producción exitosa de la progenie viral infecciosa ^{10, 11.} Las proteínas estructurales son parte de los viriones, y las proteínas no estructurales promueven las interacciones proteína-proteína necesarios para este proceso. Curiosamente, se requiere la bona fide la unión a lípidos gotita-PLIN3 proteína / TIP47 tanto para la replicación del ARN del VHC y la liberación de viriones de ^{18, 19} <sup> ^20. A pesar de estos avances recientes, los detalles mecanísticos, especialmente de las interacciones virus-huésped durante las últimas etapas de la replicación del VHC, permanecen mal definido, y la función precisa de las gotitas de lípidos es desconocida.

A continuación, describimos un método para aislar las gotitas de lípidos para la espectrometría de masas cuantitativa de proteínas asociadas. Usando este método, hemos encontrado cambios profundos en el proteoma gotas de lípidos durante la infección por VHC y identificado anexina A3 como una proteína de acogida que la co-fracciona con gotitas de lípidos y es necesario para la maduración HCV eficiente ^21.