Isolamento de gotículas de gordura para análise quantitativa Espectrometria de Massa

Gotículas lipídicas são altamente citoplasmáticos (e nucleares) organelos celulares dinâmicas compostas por um núcleo de lípidos neutros (triglicéridos (TG) e éster de colesterol (EC)) fechado por uma monocamada de fosfolípidos com proteínas incorporadas ^1. Todos os tipos de células produzem gotículas lipídicas, mas que variam em tamanho, composição lipídica, e decoração proteína. gotículas lipídicas cumprir diversas funções, incluindo a servir como reservatórios de energia e precursores de membrana ou como depósitos de proteínas. Além disso, através da absorção de lípidos, que protegem as células de lipotoxicidade, lípidos de libertação como moléculas de sinalização, e estão envolvidas na degradação da proteína e respostas a stress do retículo endoplasmático (ER) ^2. Como tal, uma série de proteínas ligar-se a gotículas de lípidos e regular a sua geração, degradação, tráfego e interacção com outros organelos. Entre elas estão a família de proteínas de ligação perilipin gotícula de lípido bona fide (PLIN1-5)f "> 3.

Lipid gota biogénese provável começa no ER, em que as enzimas ER-residente catalisar a síntese de lípidos neutros que se acumulam no interior da bicamada da membrana, formando uma lente de lípidos neutros, um processo que foi recentemente visualizado bem em levedura ^4. Membrana de dobragem e os níveis de ácido e diacilglicerol fosfatídicos elevadas são depois pensado para atrair as proteínas envolvidas na biossíntese de fosfolípido, como a síntese simultânea dos lípidos neutros e dos fosfolípidos do núcleo de blindagem é necessário para a geração de gotículas de gordura ^5. Enzimas que albergam domínios transmembranares que residem no ER catalisar este processo. Expansão de grandes gotículas lipídicas requer a actividade de uma classe diferente de enzimas de síntese de lípidos que abrigam uma hélice anfipática e pode, assim, viajam do RE para gotículas lipídicas. A mobilização de lípidos de gotículas lipídicas ocorre através da activação local do triglicéridese diacilglicerol e lipases da lipase de triglicéridos adiposo (ATGL) e sensível a hormonas lipase (HSL) ou por diferentes vias autofágicos, tais como macro e microlipophagy ou autofagia ⁶ chaperona-mediada. Gotículas lipídicas interagir com outros organelos celulares, tais como as mitocôndrias (para beta-oxidação e a síntese de lípidos) e ER (para a síntese de lípidos e o tráfico de proteína), mas também com os lisossomas, endossomas, e os vacúolos induzidas por bactérias intracelulares ^7. Com efeito bactérias, vírus, parasitas e mesmo alvo gotículas lipídicas para replicação e persistência, entre os quais o HCV ^8.

Infecção pelo HCV é uma das principais causas de morbidade relacionada com o fígado e mortalidade no mundo, respondendo por cerca de 0,5 milhões de mortes por ano ^9. O verdadeiro número de infecções por HCV é desconhecida, mas as estimativas recentes sugerem que 130 – 150 milhões de pessoas estão cronicamente infectadas. Sem vaccine existe, mas os antivirais de actuao directa recentemente aprovados aumentar dramaticamente a resposta terapêutica em comparação com a terapia à base de interferão padrão. No entanto, em todo o mundo, o tratamento de pacientes provavelmente será restrito devido aos custos extremamente elevados das novas terapias. Cerca de metade de todos os indivíduos cronicamente infectados com VHC desenvolvem a doença de fígado gordo (esteatose), uma condição caracterizada pela acumulação excessiva de gotículas lipídicas em hepatócitos. De forma intrigante, gotículas lipídicas também surgiu como organelos celulares vitais para a replicação do HCV, putativamente servir como locais de montagem virais ^{10, 11.}

Em células infectadas com HCV, a proteína do núcleo virai e NS5A localizar de gotículas lipídicas em um processo de que depende a biossíntese de triglicéridos, como inibidores de diacilglicerol aciltransferase-1 (DGAT1) prejudicar o tráfico de gotículas lipídicas e subsequente produção de partículas de HCV ¹² </sup^{>, 13, 14, 15.} Além disso, as mutações nos domínios de ligação de gotículas lipídicas de qualquer núcleo ou NS5A suprimir montagem de VHC ^{16, 17.} Núcleo e, em seguida, NS5A recrutar todas as outras proteínas virais, bem como complexos de replicação do ARN viral, para as membranas estreitamente associadas com lípidos gotas ^16. É necessária uma acção concertada de todas as proteínas virais para a produção bem sucedida de progenitura viral infecciosa ^{10, 11.} As proteínas estruturais são parte dos viriões, e as proteínas não estruturais promovem as interacções proteína-proteína necessárias para este processo. Curiosamente, o bona fide lípido-proteína de ligação de gotículas PLIN3 / TIP47 é necessário para a replicação do ARN de HCV e a libertação de viriões de ^{18, 19} <sup>, ^20. Apesar destes avanços recentes, os detalhes mecanísticos, especialmente das interacções vírus-hospedeiro durante as fases tardias da replicao do HCV, permanece mal definida, e a função precisa das gotículas lipídicas é desconhecido.

Aqui, descrevemos um método para isolar gotículas lipídicas para a espectrometria de massa quantitativa de proteínas associadas. Utilizando este método, foram encontradas alterações profundas no proteoma gotícula de lípido, durante a infecção pelo HCV e identificado anexina A3 como uma proteína hospedeira que co-fracciona com gotículas lipídicas e é necessário para a maturação de HCV eficiente ^21.