Basato sulla fluorescenza neuraminidasi Inibizione Assay per valutare la suscettibilità dei virus influenzali di neuraminidasi Inhibitor classe di antivirali

1. Determinazione della gamma lineare del prodotto fluorescente 4-MU su un Fluorometer Preparare 10 ml di 6,4 mM soluzione stock 4-MU sciogliendo 11,3 mg di 4-MU in 5 ml di etanolo assoluto. Aggiungere 5 ml di NaCl 0,9% (w / v) della soluzione di riserva per fare 10 ml. Preparare una soluzione 640 mM di lavoro diluendo 1 ml di 6,4 mM 4-MU in 9 mL di 1x tampone di saggio (acido 33,3 mM 2- (N-morfolino) etansolfonico (MES) e 4 mM CaCl 2, pH 6,5). NOTA: Preparare il tampone di saggio 2x aggiungendo 13 g di MES e 8 ml di 1 M CaCl 2 a 992 ml di acqua distillata. Regolare il pH a 6,5 ​​con 10 M di NaOH. Filtrare il tampone usando un filtro di acetato di cellulosa sterile di dimensione dei pori di 0,2 um. Attenzione! L'idrossido di sodio è caustico e può causare ustioni alla pelle e agli occhi. Assicurarsi che la piena dispositivi di protezione individuale è usurato. Preparare 5 ml di un intervallo di concentrazioni 4-MU (cioè, 5 pM, 10 pM, 20 pM, 40 pM, 80 pM, 160 e #181, M, e 320 pM) attraverso una diluizione seriale duplice di 640 pM 4-MU utilizzando tampone 1x. Dispensare 50 ml di ciascuna diluizione seriale di 4-MU (cioè, 5 pM, 10 pM, 20 pM, 40 pM, 80 pM, 160 pM, 320 pM e 640 pM) (due pozzetti per diluizione) in modo chiaro, 96- pozzetti a fondo piatto e 50 ml di tampone di saggio 1x nei pozzetti rimanenti (che servono come sbozzati per misurare segnali di fondo). NOTA: Le concentrazioni finali di 4-MU nel volume di reazione (50 microlitri 4-MU + 50 microlitri 300 uM Muñana) sono 2,5 pM, 5 pM, 10 pM, 20 pM, 40 pM, 80 pM, 160 pM e 320 uM . Preparare una soluzione stock 2,5 mM MUNANA ricostituendo 25 mg di Muñana in 20 ml di acqua distillata. Miscela 0,72 ml di 2,5 mM MUNANA con 5,28 ml di 1x tampone per ottenere una soluzione di lavoro (volume sufficiente per una piastra) 300 uM Munana. Coprire il tubo contenente il Muñana workin 300 uMSoluzione g con foglio di alluminio e tenerlo in ghiaccio meno utilizzato immediatamente. Eliminare eventuali materiali di scarto. NOTA: La soluzione madre 2,5 mM MUNANA possono essere conservati a -20 ° C per 1 mese e deve essere utilizzato entro un congelamento ciclo / disgelo. Le soluzioni 4-MU e Muñana sono sensibili alla luce e devono essere protetti dall'esposizione alla luce prolungata. Aggiungere 50 microlitri di 300 uM Muñana a ciascun pozzetto, delicatamente toccare per miscelare e incubare a 37 ° C per 30 min. Coprire la piastra con un foglio sigillante per evitare l'evaporazione. NOTA: Questo passaggio è di spiegare la fluorescenza di fondo nel saggio di inibizione NA. Preparare la soluzione di stop miscelando 11 ml di etanolo assoluto con 2.225 ml di NaOH 0,824 M (volume sufficiente per una piastra). Aggiungere 100 ml di soluzione di stop in ogni pozzetto per arrestare la reazione e picchiettare delicatamente per mescolare. Leggere la piastra utilizzando un fluorimetro con un'impostazione eccitazione lunghezza d'onda di 355 nm e un ambiente d'onda di emissione di 460 nm, come per le istruzioni del produttore. Calcolare il segnale di fondo media utilizzando segnali di fluorescenza da tutti i pozzetti non contenenti 4-MU. Sottrarre il segnale di fondo media da ciascuno dei pozzetti contenenti 4-MU e calcolare i segnali medi (RFU) per ciascuna concentrazione 4-MU. Tracciare una curva standard di RFU contro la concentrazione 4-MU (uM), come mostrato in figura 1a; una sezione lineare primo piano della curva è mostrato in Figura 1b. Visualizza la trama di RFU contro 4-MU concentrazione (pM) per determinare l'intervallo lineare ed il segnale bersaglio ottimale; il campo lineare è dove il segnale di fluorescenza aumenta proporzionalmente alle concentrazioni crescenti del 4-MU del terreno, mentre il segnale bersaglio ottimale è una concentrazione arbitrario 4-MU all'interno del range lineare. NOTA: Il range lineare e il segnale di destinazione ottimale sono specifici fluorimetro. Ad esempio, il fluorimetro al Melbourne WHOCCRRI ha una gamma lineare di 20,5-40 pM 4-MU e un segnale bersaglio ottimale di circa 30 pM 4-MU, che corrisponde a ~ 1500 RFU. 2. Determinazione del NA attività dei virus NOTA: I virus influenzali sono coltivate a titoli sufficienti a Madin-Darby Canine Kidney cellule (MDCK) o uova embrionate di pollo 8. Dispensare 120 microlitri per pozzetto di virus influenzali coltura diluiti in colonna 1 e 60 ml di tampone di saggio 1x contenente 0,1% NP-40 nei restanti 11 colonne di pozzetti 96, piastra U-bottom. Serialmente eseguire diluizione duplice dei virus attraverso la piastra (cioè, trasferire 60 microlitri dalla colonna 1 alla colonna 2 e così via, fino a colonna 11) usando una pipetta multicanale, lasciando colonna 12 come bianco contenente tampone solo 1x. Trasferire 50 ml di ciascuno dei pozzetti (virus diluito e spazi vuoti) in una, 96 pozzetti, piastra a fondo piatto chiaro. NOTA: Non è necessario cHa hange pipette se i materiali vengono trasferite dalla colonna 12 attraverso la colonna 1. Aggiungere 50 ml di 300 mM Munana (preparato secondo passo 1.4) per pozzetto e toccare delicatamente la piastra per miscelare. Incubare la piastra a 37 ° C per 1 h. Coprire la piastra con un foglio sigillante per evitare l'evaporazione. Aggiungere 100 microlitri di soluzione di arresto (preparata secondo passo 1.6) per pozzetto per bloccare la reazione e delicatamente toccare la piastra per miscelare. Leggere la piastra utilizzando un fluorimetro. Utilizzare un'impostazione lunghezza d'onda di eccitazione di 355 nm e un ambiente d'onda di emissione di 460 nm. Determinare il segnale di fondo media sulla base delle letture di fluorescenza nella colonna 12 e sottrarre il segnale di fondo media da ciascun pozzetto. Tracciare un grafico della RFU contro diluizioni di virus. NOTA: I valori di fondo per 100 micron Muñana al WHOCCRRI Melbourne sono in genere tra i 50 ei 120 RFU, ma questi saranno diverse a seconda del bei fluorimetrong utilizzato. Visualizzare la trama di RFU contro diluizioni di virus per determinare il punto medio della sezione lineare della curva per ciascun virus (Figura 2). Utilizzare il segnale bersaglio ottimale (determinato nella fase 1) come punto di riferimento. NOTA: Questo dovrebbe corrispondere alla gamma lineare 4-MU del fluorimetro determinata al punto 1 e fornirà la concentrazione appropriata di virus da utilizzare nella sezione 3. 3. Valutare Virus suscettibilità alle NA inibitori Usando il NA Inibizione Assay Preparare le scorte maestri di inibitori della NA a concentrazioni di 300 micron. Preparare 300 uM zanamivir (peso molecolare, PM = 332.32 g / mole) sciogliendo 5,0 mg di zanamivir in 50 ml di tampone di saggio 2x (66,6 mM MES e 8 mM CaCl 2, pH 6,5). Preparare 300 uM oseltamivir carbossilato (D-tartrato; PM = 386,44 g / mol) sciogliendo 5,8 mg in 50 mL di tampone 2x. Preparare300 uM peramivir triidrato (MW = 382,45 g / mol) sciogliendo 5,7 mg in 50 mL di tampone 2x. Preparare 300 uM laninamivir (MW = 346.34 g / mole) sciogliendo 5,2 mg in 50 mL di tampone 2x. NOTA: Le scorte maestro inibitori NA possono essere conservati a -20 ° C per 12 mesi. Controllare la MW degli inibitori NA per garantire i pesi e volumi corretti sono utilizzati in ricostituzione. Il carbossilato nell'uomo è il composto attivo del profarmaco fosfato oseltamivir. Pertanto, solo il carbossilato nell'uomo deve essere utilizzato nel saggio di inibizione NA. Dalle scorte master preparare scorte di dieci volte diluizioni seriali degli inibitori NA in 50 provette per centrifuga ml lavorare a concentrazioni di 0,03 nM, 0,3 nM, 3 nM, 30 nM, 300 nM, 3000 nM e 30.000 nM nel saggio 2x tampone (66,6 mM MES e 8 mM CaCl 2, pH 6,5); questo è per l'uso su più saggi. NOTA: Le concentrazioni finali di inibitori NA nel volum reazionee (50 microlitri di diluizione virus + 50 ml di inibitore NA + 50 ml di 300 mM Munana) sono 0,01 nM, 0,1 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1000 nM e 10.000 nM, rispettivamente. La concentrazione finale non include i 100 ml di soluzione di stop. Conservare tutti gli inibitori diluizioni NA a 2-8 ° C. La data di scadenza è la stessa di quella degli stock maestri. Preparare le diluizioni del virus in tampone di saggio 1x contenente 0,1% NP-40 tensioattivo in un blocco 96-pozzetti profondi. Utilizzare diluizioni del virus sulla base dei risultati del test NA attività derivate dalla sezione 2. utilizzare un volume totale di 2 ml per virus per testare quattro inibitori NA. NOTA: allestire due pozzetti (1 ml per pozzetto) per virus in un blocco di 96-deep-bene. Esempi di diluizioni di virus per il virus 1, 2, e 3 sono riportati nella Tabella 1. Erogare il volume di inibitori NA (preparati secondo passo 3.2) richiesto in un serbatoio 8 profondo bene. Da lì, dispensare 50 ml di inibitori NA a diluizioni che vanno da 0 nM (2x dosaggio bSolo Uffer) a 30.000 nM nelle righe A a H in una, 96 pozzetti, piastra a fondo piatto chiaro. NOTA: Il layout di piastra è illustrata nella figura 3. Aggiungere 50 ml di virus di prova diluiti per pozzetto alle colonne 1-11 e 50 microlitri per pozzetto di tampone 1x soltanto colonna 12. Agitare gentilmente la piastra per miscelare ed incubare a temperatura ambiente per 45 min. Coprire la piastra con un foglio sigillante per evitare l'evaporazione. Aggiungere 50 ml di 300 mM Munana (preparato secondo passo 1.4) per pozzetto e toccare delicatamente la piastra per miscelare. Incubare la piastra a 37 ° C per 1 h. Coprire la piastra con un foglio sigillante per evitare l'evaporazione. Aggiungere 100 microlitri di soluzione di arresto (preparata secondo passo 1.6) a ciascun pozzetto e picchiettare delicatamente la piastra per miscelare. Leggere la piastra utilizzando un fluorimetro. Utilizzare una lunghezza d'onda di eccitazione di 355 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 460 nm, come descritto in precedenza. 4. CalcoloIC 50 valori NOTA: La v1.2 JASPR è un software curva-montaggio che consente il calcolo dei valori di IC50. Il software è stato sviluppato dalla Divisione Influenza al CDC, Atlanta, Stati Uniti d'America. Il software utilizza l'equazione: V = V max x (1 – ([I] / (K I + [I]))), dove V max è la massima velocità del metabolismo, [I] è la concentrazione dell'inibitore, V è la risposta inibita, e K i è l'IC50 per la curva di inibizione. Copiare e incollare i dati grezzi in uscita dal fluorimetro in un foglio in un formato di piastra a 12 colonne (96 pozzetti), iniziando con cella A1. NOTA: grezzo dati da ciascuna piastra successivo deve essere sfalsati da una riga vuota. Se ogni virus è stato testato contro quattro inibitori NA, incollare i dati grezzi in un insieme di quattro (con una riga vuota tra ciascuna piastra). Aprire il software di montaggio e click sulla scheda "Experiment". Scegliere "Alternativa 2-droga Fluoro 11 campioni." Fare clic sulla scheda "Opzioni" e spuntare "generare grafici." Clicca su "Opzioni" di nuovo e fare clic sulla scheda "Nuova chiave". Salvare il file .csv "inhibition_key" nella stessa cartella del file foglio di calcolo di dati grezzi. Nel file inhibition_key, elencare tutti i nomi dei campioni di sotto della ID. Ogni nome del campione deve essere univoco. Se quattro inibitori NA sono stati testati, inserire spazi per due righe aggiuntive sotto Oseltamivir e digitare "Peramivir" e "Laninamivir". Salvare le modifiche apportate al file inhibition_key. Ritorno al "jaspr v 1.2-inibizione Curve fitting" finestra e selezionare il file di dati grezzi come il "File Experiment" e inhibition_key come il "file chiave." Eseguire l'analisi. Salvare i risultati in formato .csv e .pdf. NOTA: Il software tracciare automaticamente una curva di inibizione (RFU against NA concentrazioni di inibitore), come mostrato in Figura 4. Il programma calcola anche valori di IC50 per ciascun virus contro un individuo NA inibitore (Figura 4). Inoltre, JASPR presenta i valori di IC 50 e il segnale-fondo (S / B) il rapporto in formato foglio. I valori di fondo possono differire da un laboratorio all'altro a seconda del fluorimetro utilizzato. Al Melbourne WHOCCRRI, valorizza lo sfondo per la gamma Muñana 100 micron da 50 a 120 RFU. Per un certo valore IC50, un rapporto S / B di ≥10 è preferito, anche se un rapporto inferiore a 10 è ancora accettabile, in particolare per i virus mutanti che hanno molto bassa attività NA. Controllare i valori di IC 50 e le forme delle curve generate dal software. Tutti i punti di dati dovrebbero cadere su o vicino alla curva; se così non fosse, ripetere il test di inibizione NA. NOTA: Per i virus che mostrano insolitamente alti valori di IC 50, il dosaggio dovrebbe essere di ripetizioneEd a confermare il risultato.