Fluoreszenz-basierte Neuraminidase-Inhibitionsassay die Empfänglichkeit der Influenza-Viren an die Neuraminidase-Inhibitor-Klasse von Anti-Virus zu beurteilen

1. Ermittlung der lineare Bereich von Fluorescent Produkt 4-MU auf einem Fluorometer Herstellung von 10 ml von 6,4 mM 4-MU-Stammlösung durch Lösen von 11,3 mg von 4-MU in 5 ml absolutem Ethanol. In 5 ml 0,9% NaCl (w / v) an die Stammlösung auf 10 ml zu machen. Bereiten Sie einen 640 & mgr; M Arbeitslösung durch Verdünnen von 1 ml 6,4 mM 4-MU in 9 ml 1x Assay – Puffer (33,3 mM 2- (N-Morpholino) ethansulfonsäure (MES) und 4 mM CaCl 2, pH 6,5). HINWEIS: Vorbereiten der Puffer 2x Assay durch 13 g MES Zugabe und 8 ml 1 M CaCl 2 bis 992 ml destilliertem Wasser. Den pH-Wert auf 6,5 unter Verwendung von 10 M NaOH. Filtern der Puffer eines sterilen Celluloseacetat-Filter mit einer Porengröße von 0,2 & mgr; m verwendet. Vorsicht! Natriumhydroxid ist ätzend und kann Verätzungen an Haut und Augen verursachen. Stellen Sie sicher, dass die vollständige persönliche Schutzausrüstung getragen wird. Bereiten 5 ml eines Bereich von 4-MU – Konzentrationen (dh 5 uM, 10 uM, 20 uM, 40 uM, 80 uM, 160 & #181; M und 320 & mgr; M) durch eine zweifache serielle Verdünnung von 640 & mgr; M 4-MU 1x Assay-Puffer verwendet wird. Geben Sie 50 & mgr; l jede Reihenverdünnung von 4-MU (dh 5 uM, 10 uM, 20 uM, 40 uM, 80 uM, 160 uM, 320 uM und 640 uM) (zwei Vertiefungen pro Verdünnung) in eine klaren, 96- Well-Flachbodenplatte und 50 ul 1x Assay-Puffer in die verbleibenden Vertiefungen (die als Rohlinge dienen Hintergrundsignale zu messen). HINWEIS: Die Endkonzentrationen von 4-MU in dem Reaktionsvolumen (50 & mgr; l 4-MU + 50 & mgr; l 300 & mgr; M Munana) ist 2,5 uM, 5 uM, 10 uM, 20 uM, 40 uM, 80 uM, 160 uM und 320 uM . Vorbereiten einer 2,5 mM Stammlösung von Munana 25 mg Munana Rekonstitution in 20 ml destilliertem Wasser. Mischte 0,72 ml einer 2,5 mM MUNANA mit 5.28 ml 1x Assay-Puffer, der ein 300 uM Munana Arbeitslösung (ausreichendes Volumen für eine Platte) zu erhalten. Bedecken des Rohres wird der 300 uM Munana workin enthaltendg Lösung mit Aluminiumfolie und hält sie auf Eis, wenn nicht sofort verwendet. Entsorgen Sie alle übrig gebliebenen Materialien. HINWEIS: Die 2,5 mM MUNANA Stammlösung kann für 1 Monat bei -20 ° C gelagert werden und muss innerhalb eines Gefrier / Tau-Zyklus verwendet werden. Die 4-MU und Munana Lösungen sind lichtempfindlich und müssen bei längerer Belichtung geschützt werden. Zugeben von 50 uL 300 uM Munana in jeder Vertiefung, sanft zu mischen tippen, und Inkubieren bei 37 ° C für 30 min. Bedecken der Platte mit einer Plattenversiegelung zu verhindern Verdunstung. Anmerkung: Dieser Schritt für die Hintergrundfluoreszenz in dem NA-Inhibitionstest zu berücksichtigen ist. Bereiten Sie die Stop-Lösung von 11 ml absolutem Ethanol Mischen mit 2,225 ml 0,824 M NaOH (ausreichend Volumen für eine Platte). Je 100 & mgr; l Stopplösung in jede Vertiefung die Reaktion zu stoppen und sanft zu mischen tippen. Lesen Sie die Platte eine Fluorometer bei einer Anregungswellenlängeneinstellung von 355 nm und einer Emissionswellenlänge von 460 nm-Einstellung verwendet wird, wie PEr den Anweisungen des Herstellers. Berechnen das durchschnittliche Hintergrundsignal unter Verwendung von Fluoreszenz-Signalen von allen Vertiefungen, die keinen 4-MU. Subtrahieren diese mittlere Hintergrundsignal von jeder der Vertiefungen mit 4-MU und berechnen die Mittelwertsignale (RFU) für jede 4-MU-Konzentration. Plotten eine Standardkurve von RFU gegen die 4-MU – Konzentration (uM), wie in 1a gezeigt; Eine Nahaufnahme linearer Abschnitt der Kurve ist in Abbildung 1B gezeigt. Visualisieren die Auftragung der RFU gegen 4-MU-Konzentration (uM), um den linearen Bereich und das optimale Zielsignal zu bestimmen; Der lineare Bereich ist, wo das Fluoreszenzsignal steigt proportional zu den steigenden Konzentrationen des 4-MU auf dem Grundstück, während das optimale Zielsignal eine beliebige 4-MU-Konzentration innerhalb des linearen Bereichs liegt. HINWEIS: Der lineare Bereich und das optimale Zielsignal ist Fluorometer spezifisch. Zum Beispiel hat das Fluorometer im Melbourne WHOCCRRI einen linearen Bereich von 20,5 bis 40 & mgr; M 4-MU und ein optimales Zielsignal von ~ 30 & mgr; M 4-MU, der auf ~ 1500 RFU entspricht. 2. Bestimmung der NA Aktivität der Viren HINWEIS: Influenza – Viren gezüchtet werden , um eine ausreichende Titer in Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) -Zellen oder bebrüteten Hühnereiern 8. Dispense 120 ul pro Vertiefung von unverdünnten gezüchteten Influenzaviren in der Säule 1 und 60 & mgr; l 1x Assay-Puffers, der 0,1% NP-40 in die verbleibenden 11 Spalten einer 96-well, U-Bodenplatte. Seriell auszuführen zweifache Verdünnung der Viren über die Platte (dh Übertragung von 60 & mgr; l aus Spalte 1 bis Spalte 2 und so weiter, bis Spalte 11) , um eine Mehrkanalpipette, Spalte 12 als Rohling so dass nur 1x Assay – Puffer enthält. Übertragung von 50 ul aus jeder der Vertiefungen (verdünnte Viren und Rohlinge) in eine klare, 96-Well-Flachboden-Platte. HINWEIS: Es ist nicht notwendig, change Pipettenspitzen, wenn Materialien aus Spalte 12 bis zur Spalte 1 übertragen werden. Zugeben von 50 uL 300 uM Munana (hergestellt gemäß Schritt 1.4) pro Mulde und sanft die Platte tippen zu mischen. Inkubiere die Platte bei 37 ° C für 1 h. Bedecken der Platte mit einer Plattenversiegelung zu verhindern Verdunstung. Füge 100 & mgr; l Stopplösung (hergestellt wie in Schritt 1.6) pro Napf die Reaktion zu beenden und die Platte sanft tippen zu mischen. Lesen Sie die Platte unter Verwendung eines Fluorometers. Verwenden einer Anregungswellenlänge Einstellung von 355 nm und einer Emissionswellenlänge von 460 nm Einstellung. Bestimmen Sie das mittlere Hintergrundsignal auf den Basis der Fluoreszenzmesswerte in Spalte 12 und subtrahiert das mittlere Hintergrundsignal von jedem Well. Eine Grafik mit RFU gegen Virusverdünnungen. HINWEIS: Die Hintergrundwerte für 100 & mgr; M Munana am WHOCCRRI Melbourne sind in der Regel zwischen 50 und 120 RFU, aber diese unterscheiden sich auf dem Fluorometer bei jeng verwendet. Sehen Sie das Diagramm der RFU gegen Virusverdünnungen den Mittelpunkt des linearen Abschnitts der Kurve für jedes Virus (Abbildung 2) zu bestimmen. Verwenden des optimalen Zielsignal (bestimmt in Schritt 1) ​​als Bezugspunkt. Hinweis: dieser mit dem 4-MU linearen Bereich des Fluorometers in Abschnitt bestimmt entspricht 1 und wird die geeignete Konzentration von Viren bereitzustellen, bis 3 in Abschnitt verwendet werden. 3. Bewertung Virus Empfänglichkeit für NA-Inhibitoren Verwendung des NA-Inhibitionstest Bereiten Master Bestände von NA – Inhibitoren bei Konzentrationen von 300 uM. Bereiten 300 uM Zanamivir (Molekulargewicht MW = 332,32 g / mol) von 5,0 mg Zanamivir in 50 ml 2 × Assaypuffer aufgelöst (66,6 mM MES und 8 mM CaCl 2, pH 6,5). Bereiten 300 uM Oseltamivircarboxylat (D-Tartrat; MW = 386,44 g / mol) von 5,8 mg in 50 ml 2 × Assaypuffer gelöst wird. Bereiten300 uM peramivir Trihydrat (MW = 382,45 g / mol) von 5,7 mg in 50 ml 2 × Assaypuffer gelöst wird. Bereiten 300 uM laninamivir (MW = 346.34 g / mol) von 5,2 mg in 50 ml 2 × Assaypuffer gelöst wird. HINWEIS: Die NA-Inhibitor Master Aktien können für 12 Monate bei -20 ° C gelagert werden. Überprüfen Sie die MW der NA-Inhibitoren die richtigen Gewichte und Volumen, um sicherzustellen, sind in der Rekonstitution verwendet. Die Oseltamivircarboxylat ist der Wirkstoff des Prodrugs Oseltamivirphosphat. Daher sollten nur die Oseltamivircarboxylat in dem NA-Hemmtest verwendet werden. Von den Master-Beständen, bereite Bestände von zehnfache seriellen Verdünnungen der NA-Inhibitoren in 50 ml-Zentrifugenröhrchen in Konzentrationen von 0,03 nM arbeiten, 0,3 nM, 3 nM, 30 nM, 300 nM, 3000 nM, und 30.000 nM in 2 x Assay Puffer (66,6 mM MES und 8 mM CaCl 2, pH 6,5); Dies ist für den Einsatz in mehreren Tests. HINWEIS: Die Endkonzentrationen von NA-Inhibitoren bei der Reaktion volume (50 & mgr; l Virusverdünnung + 50 ul Inhibitor NA + 50 & mgr; l von 300 & mgr; M Munana) ist 0,01 nM, 0,1 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1000 nM und 10.000 nM. Die endgültige Konzentration enthält nicht die 100 & mgr; l Stopplösung. Speichern aller NA Inhibitoren Verdünnungen bei 2-8 ° C. Das Verfallsdatum ist das gleiche wie die der Stammaktien. Bereiten Sie die Virusverdünnungen in 1 × Assaypuffer, enthaltend 0,1% NP-40-Tensid in einer 96-Deep-Well-Block. Virusverdünnungen verwenden, basierend auf den NA-Aktivitätstest Ergebnisse von 2. Mit einem Gesamtvolumen von 2 ml pro Virus Inhibitoren testen vier NA Abschnitt abgeleitet. HINWEIS: Bereiten Sie zwei Vertiefungen (1 ml pro Vertiefung) pro Virus in einem 96-Deep-Well-Block. Beispiele für Virusverdünnungen für VIRUS 1, 2 und 3 sind in Tabelle 1 dargestellt. Dispense das erforderliche Volumen von NA-Inhibitoren (hergestellt wie in Schritt 3.2) in ein 8 Deep-Well-Reservoir. Von dort verzichtet werden 50 & mgr; l von NA-Inhibitoren bei Verdünnungen im Bereich von 0 nM (2x Assay bUffer nur) bis 30.000 nM in Reihen A bis H in einer klaren, 96-Well-Flachboden-Platte. HINWEIS: Die Plattenanordnung ist in Abbildung 3 dargestellt. Je 50 ul verdünnten Test Viren pro Vertiefung zu den Spalten 1-11 und 50 & mgr; l pro Vertiefung 1x Assay-Puffer nur bis Spalte 12 vorsichtig die Platte tippen zu mischen und 45 min bei Raumtemperatur inkubieren. Bedecken der Platte mit einer Plattenversiegelung zu verhindern Verdunstung. Zugeben von 50 uL 300 uM Munana (hergestellt gemäß Schritt 1.4) pro Mulde und sanft die Platte tippen zu mischen. Inkubiere die Platte bei 37 ° C für 1 h. Bedecken der Platte mit einer Plattenversiegelung zu verhindern Verdunstung. Füge 100 & mgr; l Stopplösung (hergestellt wie in Schritt 1.6) in jeder Vertiefung und sanft die Platte tippen zu mischen. Lesen Sie die Platte unter Verwendung eines Fluorometers. Verwenden einer Anregungswellenlänge von 355 nm und einer Emissionswellenlänge von 460 nm, wie zuvor beschrieben. 4. Berechnung vonIC50 – Werte HINWEIS: Die JASPR v1.2 ist Kurvenanpassungssoftware, die die Berechnung der IC50 – Werte ermöglicht. Die Software wurde von der Influenza-Abteilung bei der CDC, Atlanta, USA, entwickelt. Die Software verwendet die Gleichung: V = V max · (1 – ([I] / (K i + [I]))), wobei V max die maximale Geschwindigkeit des Stoffwechsels, [I] die Inhibitorkonzentration, V ist die Reaktion gehemmt wird, und K i ist der IC 50 für die Hemmungskurve. Kopieren Sie die rohen durch das Fluorometer in eine Tabellenkalkulations ausgegebenen Daten in einem 12-Säulenplattenformat (96-well), beginnend mit der Zelle A1. HINWEIS: Die Rohdaten von jeder nachfolgenden Platte muss durch eine leere Reihe versetzt angeordnet werden. Wenn jeder Virus gegen vier NA-Inhibitoren getestet wurde, fügt die Rohdaten in einem Satz von vier (mit einer leeren Zeile zwischen jeder Platte). Öffnen Sie die Anpass-Software und click auf den „Experiment“ Registerkarte. Wählen Sie "Alternative 2-Medikament Fluoro 11 Proben." Klicken Sie auf die Registerkarte „Optionen“ und aktivieren Sie „Graphen generieren.“ Klicken Sie auf „Optionen“ wieder und klicken Sie auf den „New Key“ aus. Speichern Sie die „inhibition_key“ CSV-Datei im selben Ordner wie die Rohdaten Tabellendatei. In der inhibition_key Datei listet alle Probennamen unter der ID. Jede Probe Name muss eindeutig sein. Wenn vier NA-Inhibitoren getestet wurden, legen Plätze für zwei zusätzliche Zeilen unter Oseltamivir und gibt in „Peramivir“ und „Laninamivir.“ Speichern Sie die Änderungen an der Datei inhibition_key. Zurück zu den „jaspr v 1.2-Hemmung Kurvenanpassung“ Fenster und wählen Sie die Rohdatendatei als „Experiment Datei“ und inhibition_key als „Schlüsseldatei.“ Führen Sie die Analyse. Speichern Sie die Ergebnisse in CSV und PDF-Formate. HINWEIS: Die Software wird automatisch eine Hemmung Kurve plotten (RFU against NA Inhibitorkonzentrationen), wie in Abbildung 4 gezeigt. Das Programm berechnet auch IC 50 -Werte für jedes Virus gegenüber einem einzelnen NA – Inhibitor (Abbildung 4). Zusätzlich stellt JASPR Die IC 50 -Werte und das Signal-zu-Hintergrund (S / B) -Verhältnis in Tabellenformat. Die Hintergrundwerte können von Labor zu Labor unterscheiden sich je nach dem Fluorometer verwendet. Am Melbourne WHOCCRRI Werte der Hintergrund für 100 & mgr; M Munana Bereich von 50 bis 120 RFU. Für einen zuverlässigen Wert IC 50, ein S / B – Verhältnis von ≥10 ist bevorzugt, obwohl ein Verhältnis von weniger als 10 noch akzeptabel ist, insbesondere für die mutanten Viren , die sehr niedrige NA – Aktivität aufweisen. Überprüfen Sie die IC50 – Werte und die Kurvenformen von der Software erzeugt. Alle Datenpunkte sollten fallen oder in der Nähe der Kurve; wenn sie es nicht tun, wiederholen Sie den NA-Hemmtest. HINWEIS: Für Viren , die ungewöhnlich hohe Werte 50 ICS zeigen, sollte der Test wiederholen seined das Ergebnis zu bestätigen.