JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Divulgaciones
Acknowledgements
Materials
Referencias
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biología del desarrollo

Embriyonik Kök Hücre Pluripotansını Yüksek Verimli İnhibitör Taramayla Düzenleyen Kinazları Tanımlamak İçin Basit Bir Yöntem

Published: May 12, 2017
doi:
10.3791/55515
, ,
1The MRC Protein Phosphorylation and Ubiquitylation Unit, School of Life Sciences,University of Dundee, 2Department of Cancer Biology,Dana-Farber Cancer Institute, 3Department of Biological Chemistry and Molecular Pharmacology,Harvard Medical School

Summary

Burada, saf ön hazırlıklı pluripotent geçiş kinaz regülatörleri için hedeflenmiş küçük molekül ekranları gerçekleştirmek için nicel ve ölçeklenebilir bir protokol sunuyoruz.

Abstract

Embriyonik kök hücreler (ESC'ler), kendi kendini yenileyebilir veya pluripotency olarak bilinen bir fenomen olan tüm hücre tiplerine farklılaşabilir. Belirgin pluripotent durumlar "naif" ve "astarlanmış" pluripotency olarak adlandırılmıştır. Saf önlemli geçişi kontrol altına alan mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır. Özellikle, kinetik fonksiyonu araştırmak için yüksek kaliteli alet bileşiklerinin mevcudiyetinin artmasına rağmen, naif ve başlangıçlı pluripotent durumları belirten protein kinazlar hakkında kötü bilgi sahibiyiz. Burada, fare ESC'lerindeki naif başlatılmış pluripotent geçişin kinaz düzenleyicileri için hedeflenmiş küçük moleküler ekranlar gerçekleştirmek için ölçeklenebilir bir platform açıklanmaktadır. Bu yaklaşım, basit hücre kültürü koşullarını ve standart reaktifleri, materyalleri ve ekipmanı kullanarak, pluripotens üzerine şimdiye dek değinilmemiş etkileri olan kinaz inhibitörlerini açığa çıkarır ve onaylar. Bu teknolojinin potansiyel uygulamalarını tartışıyoruz, diğer küçük moleküllerin taranması da dahilGiderek sofistike kinaz inhibitörleri ve ortaya çıkan epigenetik araç bileşiklerinin kütüphaneleri gibi koleksiyonlar.

Introduction

Embriyonik kök hücreler (ESC'ler), pluripotens 1 olarak bilinen bir fenomen olan yetişkin vücuttaki herhangi bir hücre türüne kendi kendine yenilenme veya ayırma kapasitesine sahiptir. Yeni kanıtlar, "naif" ve "astarlanmış" pluripotency olarak adlandırılan, gelişimsel olarak farklı pluripotent durumların var olduğunu ortaya koymaktadır. Naif ESCler, preimplantasyon embriyo 3'dekine benzer bir gelişim halini temsil eder. Buna karşın, başlatılmış pluripotent ESC'ler pluripotency'den çıkmak ve özelleştirilmiş embriyonik soylara ayırmak için hazırlanırlar 4 , 5 .

Naive ve primer pluripotent devletler ayrı gen düzenleyici ağlarla işaretlenir. Naif pluripotik, Nanog, Krueppel benzeri transkripsiyon faktörleri (Klfs), Rex1 2 ve Esrrb gibi anahtar pluripotens transkripsiyon faktörlerinin ekspresyonuyla karakterizedir <supClass = "xref"> 6. Fare ESC'lerde (mESC'ler), başlangıçtaki pluripotens, naif belirteçlerin azaltılmış ifadesi ve de novo DNA metil transferaz Dnmt3b'yi içeren spesifik bir gen ekspresyon imza ile karakterize edilir 7 . In vivo , primer pluripotent implant sonrası epiblast kök hücreleri (EpiSCs) 4 , 5 ek olarak Epiblast markörü Fgf5'i ve Brachyury 8 gibi soy primingin belirteçlerini ifade eder.

MESC'ler , in vitro saf ön provizyonlu pluripotent geçişleri kontrol eden prob mekanizmalarına uygulanabilir bir model sağlar. Lösemi inhibitör faktör (LIF) ve fetal sığır serumu (FBS) ile kültürlendiğinde, mESC'ler saf ve başlangıçlı pluripotent durumlar arasında dinamik geçiş yapar 9 , 10 . Naif bir gen düzenleyici ağı teşvik etmek için LIF-Jak-Stat3 sinyalizasyon işlevleri 11 </Fibroblast büyüme faktörü 4 (Fgf4) Erk1 / 2 yolak yoluyla otokrin sinyalizasyon, astar hal 12'ye geçişi sağlar. Bununla birlikte, protein kinazların farklı pluripotent durumların belirlenmesindeki rolünü sistematik olarak değerlendirmek de bir meydan okuma olmaya devam etmektedir.

Burada, saf ön hazırlıklı pluripotent geçiş kinaz regülatörleri için hedeflenmiş küçük moleküler elekleri gerçekleştirmek için nicel ve ölçeklenebilir bir platform açıklanmaktadır. Basit parazit mukavemeti stabilize etme yeteneği ile kinaz inhibitörlerini ortaya çıkarmak ve doğrulamak için basit mESC kültür koşullarını ve standart reaktifleri, malzemeleri ve ekipmanları kullanırız. Ayrıca, epigenetik düzenleyicileri hedef alan gelişmekte olan inhibitör kütüphaneleri gibi diğer küçük molekül koleksiyonlarının taranması da dahil olmak üzere, bu teknoloji için potansiyel genişletilmiş uygulamaları tartışıyoruz.

Protocol

1. Küçük Molekül Kinaz İnhibitör Kütüphanelerinin Harmanlanması Herkes tarafından erişilebilen kinaz inhibitör koleksiyonlarından elde edilen harmanlama inhibitörü kütüphaneleri, örneğin 228 güçlü ve seçici kinaz inhibitörlerinden (http://lincs.hms.harvard.edu) oluşan bir koleksiyon olan Harvard Medical School'tan Entegre Ağa Dayalı Hücresel İmzalar Kütüphanesi (LINCS) Ve endüstriyel araştırmacılar tarafından bir araya getirilen 376 bileşik koleksiyonu olan Protein Kinaz İnhibitör Seti (PKIS) (https://www.ebi.ac.uk/chembldb/extra/PKIS) 13 bulunmaktadır. Alternatif olarak, ticari olarak temin edilebilen bileşiklerden bir ısmarlama kinaz önleyici koleksiyonu monte edin. NOT: Laboratuarımızda, hepsi ticari kaynaklardan temin edilebilen 51 primer hedef kinazı kapsayan 72 güçlü ve seçici takım kinaz inhibitörü topluluğunu bir araya getirdik. Birden fazla konsantrasyonda optimum yüksek verimli işleme için kinaz inhibitörlerini 96 oyuklu plakalar halinde bir araya getirin (kullanım 1, 0.1 aNd 0.01 mM). Her bir plakaya sırasıyla saf DMSO içeren referans plakaları ve sırasıyla naif ve primer pluripotent durumu teşvik ettiği bilinen referans kontrol inhibitörleri PD173074 (FGFRi) ve Ruxolitinib'i (JAKi) ekleyin. Elektronik tablo veya benzeri bir yazılımda açıklama yapın. 2. MESC Kültür Hazırlama Şartları ve Prosedürleri 10 cm tabaklara% 0.1 (w / v) jelatin 5 ml ekleyerek% 0.1 jelatin kaplı 10 cm yemekleri hazırlayın ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. Jelatı alın ve 2 dakika boyunca tabağı kurumaya bırakın. 100 ng / mL GST-LIF,% 10 Fetal Buzağı Serum ve% 5 Nakavt Serumu içeren standart mESC ortamında (bkz. Malzeme Tablosu )% 0.1 jelatin kaplı 10 cm bulaşıkların 37 ° C'lik% 5 CO 2'de herhangi bir standart mESC hattını kültürleyin Değiştirme. Her geçen gün medyayı değiştirin ve her iki günde bir% 80 konfluenasyondaki MESC'leri 1: 5-1: 10'luk bir seyreltme ile geçirin. MESC'leri geçmek için, ortamı aspire edin ve 5 mL o ile yıkayın.F fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkanır. MESC plakası başına 1 mL tripsin-EDTA (% 0.05 0.05 tripsin,% 0.02 EDTA) ekleyin ve 10 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. 4 mL'lik mESC medyumunda tripsinize edilmiş hücreleri tekrar süspansiyon haline getirin ve 5 dakika süreyle 1,200 rpm'de santrifüjleyin. Tek bir hücre süspansiyonu üretmek için yukarı ve aşağı pipetleme, 5 mL'lik mESC ortamı içinde hücre topağını iyice süspanse edin. 10 mcL hücre süspansiyonu ve 10 mcL Trypan Mavisi (% 0.4) birleştirerek hücreleri sayın. Bir hücre sayma odasına yerleştirin veya bir hemositometre ve ışık mikroskopu kullanın. Çok kanallı bir pipet kullanarak% 0.1 jelatin kaplı 96 gözlü plakalara, son hacimde 100 uL medyaya 3 x 10 3 mESC tohumlayın. Bir çok kanallı pipet kullanarak kinaz inhibitörlerini 1: 100 seyreltmede (1 uL inhibitör 100 uL medyaya ilave edilir) uygulayın. İnhibitör ve hücre süspansiyonunu karıştırmak için hafifçe pipetle sıkıştırın, daha sonra eşit dağılımı sağlamak için 1 saat boyunca hücrelerin bir doku kültürü kapağına yerleşmesine izin verin.Kaplama yüzeyi. Medyayı değiştirmeden 48 saat boyunca kültür hücreleri. NOT: 1 / 0.1 / 0.01 mM stok plakaları, sırasıyla 10/1 / 0.1 μM son bir inhibitör konsantrasyonu verecektir. Hedef dışı etkileri en aza indirirken birincil hedef kinazların etkin bir şekilde inhibe edilmesini sağlamak için, ekranı 1 μM son konsantrasyonda başlatmanızı öneririz. 3. Kinaz İnhibitör Tarama Analizi Çok kanallı aspiratör ve pipetleri kullanarak 200 mcL PBS'de 96 oyuklu mESC plakalarını yıkayın. 150 μL liziz tamponu (20 mM Tris pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA,% 1 NP-40 (v / v),% 0.5 sodyum deoksikolat (w / v), 10 mM β-gliserofosfat , 10 mM sodyum pirofosfat, 1 mM NaF, 2 mM Na3V04, Komple Proteaz İnhibitörü Kokteyl Tabletleri). Özleri, V-tabanlı 96 oyuklu plakalarda 30 dakika 1,500 xg'de santrifüjle açıklayın. Bir nitrol üzerine 100 μL süpernatantları hareketsiz hale getirinLüloz membran kullanılarak 96 oyuklu vakum nokta leke manifoldu kullanıldı. Membranı kurutun ve tutarlı transferi sağlamak için 40 mL Ponceau S ile leke uygulayın. Membranı TBST ile yıkayın ve TBST /% 3 (ağırlık / hacim) sütte bloke edin. Nanog ve Dnmt3b antikorlarında TBST /% 3 (ağırlık / hacim) süt tozu içinde gece boyunca 1: 1000 (v / v) seyreltme ile inkübe edin. Membranları TBST içinde 3 x 10 dakika yıkayın ve TBST /% 3 (ağırlık / hacim) sütte 1: 10,000 (v / v) seyreltilmiş 30 mL ikincil antikor içerisinde inkübe edin. Dijital immünobotlama görüntüleme sistemi kullanarak geliştirin. NOT: Mümkünse, Nanog ve Dnmt3b'yi tespit etmek için kantitatif floresans immünoblotlama kullanın. Bununla birlikte, floresans immünoblotlama ile Dnmt3b için arka plan sinyali çok yüksektir. Bu nedenle, 800 nm floresans anti-tavşan (Nanog) ve anti-fare-HRP (Dnmt3b) sekonder antikorlar kullanılır. 4. Ekran Verilerinin Analizi ve Bona Fide Pluripens Regülatörleri Olarak İnhibitörlerin Validasyonu <p class="jove_content"> NOT: Bu sadece iyi niyetli pluripotens modülatörlerinin tanımlanmasını sağlamak için kritik bir adımdır. Hem Nanog: Dnmt3b oranına, hem de genel sinyal temelli inhibitörlerin, mESC sağkalımını olumsuz yönde etkileyen kinaz inhibitörlerinin daha ileri analiz için seçilmemesini sağlamak için ayrılması zorunludur. İmmünoblot analizi yazılımı kullanarak Nanog ve Dnmt3b sinyalini nicelleştirin ve değerleri bir elektronik tabloya veya benzer bir yazılıma aktarın. DMSO kontrolü ile karşılaştırıldığında tüm numuneler için Nanog: Dnmt3b oranını hesaplayın. Ayrıca, kinaz inhibitörlerinin, mESC canlılığını değiştirerek Nanog: Dnmt3b oranını etkilemediğinden emin olmak için toplam Nanog ve Dnmt3b sinyalini belirleyin. Saf bulleşikliği (Nanog: Kontrolten daha yüksek olan Dnmt3b oranı) ve başlatılmış pluripotansı (Nanog: Dnmt3b oranı kontrolden düşük) teşvik eden inhibitörleri tanımlamak için sıralı Nanog: Dnmt3b oranlarını kullanın. Kontrol değerlerinden 2x sapma değerinde kesme değerini ayarlayın ve toplam Nanog + Dnmt3b sinyali üreten kinaz inhibitörlerini filtreleyinNaif (yüksek Nanog: Dnmt3b oranı) ve astarlanmış (düşük Nanog: Dnmt3b oranı) pluripotent durumları stabilize eden kinaz inhibitörlerinin yüksek bir güven listesinin üretilmesi için DMSO kontrol değerinin% 50'si. 2 mL'lik ortamda 6 kuyucukta 2 x 105 hücreye mESC'leri ekleyerek kinaz inhibitörlerini doğrulayın ve ortam değiştirmeden 48 saat boyunca 1 uM'de kinaz inhibitörleri ekleyin. MESC'leri liziz tamponunda Lyse edin ve geleneksel SDS-PAGE imünoblotlama ile Nanog ve Dnmt3b ekspresyonunu analiz edin. Çabukluğun, 48 saatlik inhibitör tedavisinin ardından muhafaza edildiğinden emin olmak için, Naif pluripotik belirteçler Klf2 ve Klf4 ve Oct4'ün SDS-PAGE immünoblotlaması ile isabetlerini doğrulayın.

Representative Results

Burada sunulan prosedürü kullanarak ( Şekil 1 ), 228 güçlü ve seçici kinaz inhibitörünün LINCS kütüphanesini tarayarak mESC pluripotensini modüle edenleri belirledik. Kütüphane, 1: 100 seyreltme için 0.1 mM konsantrasyonda ve mESC'lerde 1 uM son tarama konsantrasyonunda hazırlanır. 48 saat sonra, mESC'ler parçalandı ve Nanog ve Dnmt3b ifadesinin kantitatif nokta leke analizi için ekstraktlar hazırlandı ( Şekil 2 , üstte). Diğer tarama konsantrasyonlarından elde edilen sonuçlar burada kısalık olarak gösterilmez. Nanog: Dnmt3b oranı her kinaz inhibitörü ve bileşenler için sıralanır ve 2x kesme uygulanır ( Şekil 2 , alt). Kontrolle ilgili toplam Nanog ve Dnmt3b sinyali, inhibitör sıralamasına bindirilir ve önemli mESC toksisitesini gösteren inhibitörlerin triazasyonuna izin vermek için 0.5x kesime tabi tutulur. Safevatı stabilize eden kinaz inhibitörlerini seçinGeleneksel Nanog / Dnmt3b immünoblotlama ( Şekil 3 ) kullanılarak doğrulanır. Bu inhibitörlerin primer kinaz hedefleri Tablo 1'de sunulmuştur. Bu ekranın, astarlanmış hali stabilize eden inhibitörleri tanımlamak için uygulanabilirliğini de göstermekteyiz 14 . Şekil 1: Saf başlangıçlı geçiş modüle eden kinaz inhibitörlerinin taranması için iş akışı. MESC, 1 uM'lik nihai konsantrasyonda bir 228 bileşik kinaz inhibitör kütüphanesi ile muamele edildi. Lizatlar hazırlandı ve immüno nokta-leke analizi için nitroselüloz membranlara aktarıldı ve Nanog ve Dnmt3b seviyeleri belirlendi (Şekil 14 , Williams ve diğerleri 14'den adapte edildi). Görmek için lütfen buraya tıklayınız. Bu rakamın daha yükseği yok. Şekil 2: Naive ile hazırlanmış pluripotens ekran analizi ve inhibitör tanımlama. (Üstteki) Temsilci Nanog ve Dnmt3b immüno nokta-lekeli görüntüler. (Alt) Her kinaz inhibitörü için Nanog ve Dnm3b değerleri DMSO kontrolüne göre belirlendi ve Nanog: Dnmt3b oranları ve toplam nispi Nanog + Dnmt3b sinyali belirlendi ve inhibitörler DMSO kontrolüne kıyasla sıralandı. Nanog: Dnmt3b oranını, DMSO kontrolünün üstünde veya altındaki 2 misli eşiğin ötesinde değiştirenlerin, naif veya başlatılmış pluripotensin sürücüleri olduğu tespit edildi. DMSO kontrolünün 2x altında bir eşik değeri, mESC sağkalımını tehdit eden inhibitörlerin triaj edilmesi için ayarlandı. Daha ileri doğrulama için seçilen inhibitörler vurgulanır. (Şekil, Williams ve diğerleri 14'den uyarlanmıştır ).S / ftp_upload / 55515 / 55515fig2large.jpg "target =" _ blank "> Bu rakamın daha büyük sürümünü görmek için lütfen tıklayınız. Şekil 3: Belirlenen seçilmiş isabet bileşiklerinin doğrulanması. MESC'ler ya 1 uM AZD4547 (seçici bir FGFR önleyicisi) ya da Şekil 2'deki ekrandan belirlenen belirtilen inhibitörler ile muamele edildi. Nanog: Dnmt3b seviyeleri standart SDS-PAGE ve immünoblot analizi ile belirlendi. Göreceli Nanog: Dnmt3b ve Nanog + Dnmt3b'nin sayısal değerleri aşağıdaki tabloda gösterilmiştir ve naif pluripotent durumu stabilize eden inhibitörler yeşil renkte vurgulanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız. bileşik Birincil Hedefler Diğer Hedefler AV-951 VEGFR HG-6-64-01 ABL, BRAF, RET, CSF1R, EGFR, EPHA8, FGFR, FLT3, KIT, LOK, MAP4K1, p38b, MUSK, PDGFR, TAOK3, TNNI3K WH-4-023 Lck src R406 Syk GW-572016 HER2 EGFR KIN001-244 PDK1 WZ-4-145 CSF1R, DDR1, EGFR, TIE1, PDGFR2 WZ-7043 CSF1R, DDR1, FGFR ve TAO1 GW786034 VEGFR1'inin VEGFR2, VEGFR3 &# 160; AZD-1480 JAK2'dir Tablo 1: Seçilen isabet bileşikleri ve bunların primer kinaz hedefleri.

Discussion

Burada, naif başlangıçlı pluripotent geçişin düzenlenmesinde kinaz sinyal yollarının rolünü araştırmak için yaygın olarak erişilebilen bir metodolojiyi göstermektedir. Bu ESC alanında önemli bir soruyu ele alıyor. Yüksek verimli genomik ve transkriptomik yaklaşımlar, naif ve başlangıçlı pluripotent durumların anahtar transkripsiyonel regülatörlerini tanımlamak için rutin olarak kullanılır, ancak pluripotens sinyal şebekelerini aydınlatmanın zor olduğu kanıtlanmıştır. Şimdi, mESC'lerde naif başlangıçlı pluripotent geçişini kontrol eden kinazları tanımlamak için kimyasal inhibitörleri kullanan esnek bir strateji sunuyoruz. Bu, hücrenin sinyal verme ve ESC biyolojisi üzerine çalışan çoğu laboratuarda bulunan basit ekipman, reaktifler ve malzemeler üzerine kuruludur. Bu platformun başarısı için kritik olan, naif ve başlatılmış pluripotent durumlar arasındaki geçişin nicelleştirilmesi için sağlam bir analiz geliştirmemizdir. Bu tahlilin oluşturulması, hücre platinde önemli iteratif değişiklikler gerektirdiYoğunluk, inhibitör inkubasyon zamanı ve immunoblotlama koşulları.

Küçük molekül yaklaşımları, terapötik ESC uygulamalarında rasyonel kullanım için çekiş kazanmaktadır 15 , 16 . Küçük molekül taramalarının önemli bir gücü, araç bileşimlerinin etkin hücre alımı için tasarlanmış ve / veya modifiye edilmiş olmasıdır. Transfeksiyon etkinliği sınırlayıcı değildir ve lentivirüs gibi tehlikeli iletim sistemlerinin kullanılması gerekli değildir. Ayrıca, inhibitörler sıklıkla bir kinaz ailesi ( örn. , Fgfr1-4, Jak1-3) içindeki birden fazla izoformu inhibe eder ve RNAi ve CRISPR / Cas9 gibi genetik / genetik girişim tekniklerini engelleyen fonksiyonel fazlalığın üstesinden gelir. Hem akademik hem de farmasötik ilaç keşfi programlarından daha güçlü ve seçici araç bileşikleri elde edildiğinde, az öğrenilen ve iyi anlaşılmayan kinazlar ESC araştırmasının ön planına itilecektir. Bu nedenle, bu yüksekKaba yeme tarama yaklaşımı, temel ESC düzenleyici ağlarına yeni araştırma yolları açacaktır.

Bu teknolojinin küçük bir kısıtlaması, en güçlü ve seçici küçük molekül inhibitörleri bile in vivo çoklu ilgisiz kinazlarla etkileşime girip engellemektir. Bununla birlikte, gittikçe genişleyen kinaz inhibitörü profil verisi, kinaz inhibitörlerinin işlevsel hedeflerinin kolayca tanımlanmasına izin verir (http://lincs.hms.harvard.edu/kinomescan; http://www.kinase-screen.mrc.ac.uk/kinase -inhibitors). Son olarak, prensip olarak, platformumuz, yüksek kaliteli immünoblot antikorlarının bulunduğu herhangi bir küçük molekül toplama ve / veya hücresel tahlilin sorgulanması için uygulanabilir. Bu, pluripotens regülasyonunda çoklu düzenleyici sistemlerin incelenmesine ve çeşitli hücresel prosesleri değiştiren küçük molekül inhibitörlerinin tanımlanmasını kolaylaştıracaktır. Özellikle, epijen gibi ortaya çıkan küçük molekül koleksiyonlarınınYapısal Genomik Konsorsiyumu (http://www.thesgc.org/chemical-probes/epigenetics) tarafından geliştirilen tik problar, pluripotent geçişlerin daha yeni regülatörlerini ortaya çıkarma potansiyeline sahiptir.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

CACW bir Tıbbi Araştırma Konseyi doktora öğrencisi tarafından desteklenmektedir. GMF kısmen Tıbbi Araştırma Konseyi Yeni Araştırmacı Ödülü (MR / N000609 / 1) ve Tenovus İskoçya araştırma ödeneği tarafından desteklenmektedir.

Materials

mESC media
CCE mESCs ATCC ATCC SCRC-1023
DMEM Media Gibco 11965092
L-Glutamine Gibco 25030081 Final: 2mM
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140122 Final: 50U/ml
2-mercaptoethanol Sigma M6250 Final: 0.1mM
Leukemia Inhibitory Factor (GST fusion) MRC-PPU reagents and services Final: 100ng/ml
Leukemia Inhibitory Factor Thermo PMC9484 Final: 100ng/ml
Non-Essential Amino Acids Gibco 11140050 Final: 0.1mM
Sodium Pyruvate Gibco 11360070 Final: 1mM
KnockOut Serum Replacement Invitrogen 10828-028 Final: 5%
Defined Fetal Bovine Serum Fisher 10703464 Final: 10%
Name Company Catalog Number Comments
TC materials
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Thermo 25300054 
Gelatin from porcine skin Sigma 1890
Nunc MicroWell 96-Well Microplates Thermo 156545
DPBS, no calcium, no magnesium Gibco 14190136
V-bottom 96 well plates Greiner Bio-one 651261
Name Company Catalog Number Comments
Lysis Buffer
Tris buffer VWR 103157P
Sodium Chloride VWR 97061
EDTA Sigma E4884
1% NP-40 Sigma 9016-45-9
Sodium Deoxycholate Sigma D6750-100g
β-glycerophosphate Sigma G9422
Sodium Pyrophosphate Sigma 13472-36-1
Sodium Fluoride Sigma 450022
Sodium Orthovanadate Sigma 450243
Roche Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets Sigma CO-RO
Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
Tween Sigma P1379-1L
Milk Powder Marvel
Name Company Catalog Number Comments
Western Blotting
Protran BA 85 Nitrocellulose 0.45uM  Pore size (20 X 20cm Sheets) (25 Sheet) GE 10401191
Ponceau S Sigma P7170-1L
Name Company Catalog Number Comments
Laboratory Equipment
Minifold I System GE 10447850
ChemiDoc imager BioRad 1708280 
LiCor Odyssey Imager LiCor
Name Company Catalog Number Comments
Antibodies
Anti-mouse Nanog Reprocell RCAB001P
Anti-Dnmt3b Imgenex IMG-184A
IRDye 800CW Donkey anti-Rabbit Licor 926-32213
Anti-mouse-HRP Cell Signalling Technology 7076S
Anti-Klf2 Millipore 09-820
Anti-Klf4 R&D Systems AF3158
Anti-Oct4 Santa Cruz sc-5279
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referencias

  1. Evans, M. J., Kaufman, M. H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292 (5819), 154-156 (1981).
  2. Nichols, J., Smith, A. Naive and primed pluripotent states. Cell Stem Cell. 4 (6), 487-492 (2009).
  3. Boroviak, T., et al. Lineage-Specific Profiling Delineates the Emergence and Progression of Naive Pluripotency in Mammalian Embryogenesis. Developmental Cell. 35 (3), 366-382 (2015).
  4. Tesar, P. J., et al. New cell lines from mouse epiblast share defining features with human embryonic stem cells. Nature. 448 (7150), 196-199 (2007).
  5. Brons, I. G. M., et al. Derivation of pluripotent epiblast stem cells from mammalian embryos. Nature. 448 (7150), 191-195 (2007).
  6. Festuccia, N., et al. Esrrb is a direct Nanog target gene that can substitute for Nanog function in pluripotent cells. Cell Stem Cell. 11 (4), 477-490 (2012).
  7. Ficz, G., et al. FGF signaling inhibition in ESCs drives rapid genome-wide demethylation to the epigenetic ground state of pluripotency. Cell Stem Cell. 13 (3), 351-359 (2013).
  8. Guo, G., et al. Klf4 reverts developmentally programmed restriction of ground state pluripotency. Development. 136 (7), 1063-1069 (2009).
  9. Chambers, I., et al. Nanog safeguards pluripotency and mediates germline development. Nature. 450 (7173), 1230-1234 (2007).
  10. Findlay, G. M., et al. Interaction domains of Sos1/Grb2 are finely tuned for cooperative control of embryonic stem cell fate. Cell. 152 (5), 1008-1020 (2013).
  11. Niwa, H., Burdon, T., Chambers, I., Smith, A. Self-renewal of pluripotent embryonic stem cells is mediated via activation of STAT3. Genes Dev. 12 (13), 2048-2060 (1998).
  12. Kunath, T., et al. FGF stimulation of the Erk1/2 signalling cascade triggers transition of pluripotent embryonic stem cells from self-renewal to lineage commitment. Development. 134 (16), 2895-2902 (2007).
  13. Elkins, J. M., et al. Comprehensive characterization of the Published Kinase Inhibitor Set. Nature Biotechnology. 34 (1), 95-103 (2016).
  14. Williams, C. A. C., et al. Erk5 Is a Key Regulator of Naive-Primed Transition and Embryonic Stem Cell Identity. Cell Reports. 16 (7), 1820-1828 (2016).
  15. Cao, N., et al. Conversion of human fibroblasts into functional cardiomyocytes by small molecules. Science. 352 (6290), (2016).
  16. Zhang, M., et al. Pharmacological reprogramming of fibroblasts into neural stem cells by signaling-directed transcriptional activation. Cell Stem Cell. 18 (5), 653-667 (2016).

Tags

Embryonic Stem CellPluripotencyKinase Inhibitor ScreeningHigh-throughputNovel Signaling PathwaysMouse ES CellsGelatin CoatingCell CultureTrypsinizationCell Counting96-well PlateKinase Inhibitor Treatment

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artículo
Williams, C. A. C., Gray, N. S., Findlay, G. M. A Simple Method to Identify Kinases That Regulate Embryonic Stem Cell Pluripotency by High-throughput Inhibitor Screening. J. Vis. Exp. (123), e55515, doi:10.3791/55515 (2017).
Descargar cita
Reimpresiones y permisos

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image