블루 기본 페이지와 단백질 상관 관계 프로파일 링에 의한 선호도 정제 단백질 복합체 해결

FLAG 선호도 정화하여 기본 단백질 복합체의 1. 분리 준비 세포 펠렛을 해동을 위해 37 ° C의 물을 욕조를 설정합니다. 4 ° C에 마이크로 원심을 냉각. 크기가 다른 여러 마이크로 원심 튜브 (1.5 ㎖, 15 mL) 및 얼음의 균질화를 놓는다. 용해 완충액 (50 mM Tris-HCl pH를 8, 150 mM의 염화나트륨, 0.1 % Nonidet P-40, 1 mM의 EDTA)을 10 ㎖를 준비하고 얼음에 보관. 직전의 버퍼를 사용하여 10의 1 M DTT μL 및 EDTA 프리 프로테아제 억제제의 분쇄 된 정제를 추가한다. 항체 결합 구슬의 준비 참고 : 항체 코팅 구슬 미리 주일까지 준비하고 필요할 때까지 냉장고에 보관하실 수 있습니다. 대부분의 종은 높은 친 화성을 가지는 단백질을 토끼 IgG를 제외한, 아형 면역 글로불린 단백질은 G 단백질 (A)보다 높은 친 화성을 갖는다. 50 μL 단백질 G 코팅 된 자성 비드 씻겨 : 전송을 50# 956; 미세 원심 분리 튜브에 비드 슬러리의 L은 튜브 측의 비드를 수집하여, 액체를 제거하기 위해 자석에 튜브를 놓는다. PBS-0.01 % 트윈 20, 0.5 mL의 비드를 재현 탁. 튜브의 측면에 비드를 수집하여, 액체를 제거하기 위해 자석에 튜브를 놓는다. PBS-0.01 % 트윈 -20, 40 μL의 비드를 재현 탁. 10 μg의 (1 ㎎을 10 μL / ㎖ 원액) M2 항 FLAG 항체를 추가한다. 실온에서 20 분 동안 회전 인큐베이션. 튜브의 측면에 비드를 수집하여, 액체를 제거하기 위해 자석에 튜브를 놓는다. PBS-0.01 % 트윈 20, 0.5 ㎖의 비드를 세척 하였다. 비드에 항체를 가교를 들어, 0.2 M 트리에탄올 아민 pH를 8.2 mL로 1 회 비드를 세척 하였다. 다음으로, (사용 직전에 제조한다 신선한 DMP 용액) 트리에탄올 아민 0.2 M의 pH를 8.2에서 20mM의 ​​DMP (디메틸 pimelimidate) 1 ㎖에 재현 탁 비즈. 실온에서 30 분 동안 회전 인큐베이션. </리> 자석에 튜브를 놓습니다. 상청액을 제거하고 50 mM 트리스 – 염산 pH를 7.5 0.5 mL에 비드를 재현 탁. 실온에서 15 분 동안 회전 인큐베이션. PBS-0.1 % 트윈 -20 0.5 ㎖의 비드를 3 회 반복한다. 필요할 때까지 마지막 세척에 구슬을 둡니다. FLAG 계 친화 정제 참고 : 오랜 시간 동안 버퍼없이 구슬을 떠나지 않을에주의하십시오. 모든 버퍼 및 튜브는 항상 얼음에 보관해야합니다. 다음 프로토콜은 FLAG 표지 된 단백질 (20)의 내인성 수준을 발현 2-5 × 108 세포로부터 단백질 복합체의 정제 (10-20 mg의 단백질 용 해물)에 최적화되어있다. 이 녹기 시작할 때까지 37 ℃에서 수욕에서 세포 펠렛을 해동. , 욕조에서 튜브를 타고 펠렛가 완전히 해동 될 때까지 부드럽게 소용돌이, 즉시 얼음에 세포 현탁액을 포함하는 튜브를 배치합니다. 빙냉 용해 완충액 5 mL를 추가세포 현탁액에 소용돌이 (DTT 및 프로테아제 억제제를 함유하는) 혼합한다. 10 분 동안 얼음에서 인큐베이션. 감기 다운스 균질에 해물을 전송합니다. (눈에 띄는 점도이 없을 때까지) 꽉 유봉을 사용하여 20 ~ 30 스트로크를 Lyse. 차가운 마이크로 원심 튜브에 균질를 전송합니다. 4 ℃에서 15 분 동안 18,000 XG 원심 분리기. 깨끗하고 차가운 튜브에 분해물을 전송합니다. 뒤에 용해 액 50 μL를 남겨주세요. 단백질 농도를 측정하고 정화를 모니터링 할 해물의 35 μL 나누어지는 가져 가라. 구슬에서 PBS-0.1 % 트윈 20을 제거합니다. 분해물의 1 mL로 구슬을 재현 탁과 해물의 나머지 부분과 섞는다. 1-2 시간 동안 4 ℃에서 회전 휠의 혼합물을 인큐베이션. 자석과 튜브의 측면에 구슬을 수집합니다. 상층 액의 30 μL 나누어지는을 수집하고 상등액의 나머지 부분을 폐기합니다. IPP150 완충액 (10 mM 트리스 – 염산 pH를 8 (15)의 0.5 mL의 비드를 재현 탁0 mM의 염화나트륨, 1mM의 EDTA, 0.1 % NP-40) 4-6 회 피펫 팅. 1.5 mL의 차가운 튜브에 전송합니다. IPP150 버퍼 두 번 이상 0.5 mL로 세척을 반복한다. 워시 FLAG 고유 용출 완충액 (20 mM의 비스 – 트리스 pH가 7, 20 mM의 염화나트륨, 0.02 % Nonidet P-40, 1 mM의 EDTA, 200 mM의 ε 아미노 카프로 산) 0.5 mL로 세 번 구슬. 마지막 세척과 함께, 새로운 냉각 튜브에 구슬을 전송합니다. 철저하게 버퍼를 제거합니다. 고유 용출 완충액 200 ㎍ / ㎖의 3 배 FLAG 펩티드를 100 μL의 비드를 재현 탁. 부드러운 회전을 10 분 동안 4 ℃에서 인큐베이션. 자석에 구슬을 수집하고 차가운 새로운 튜브에 뜨는을 전송합니다. 반복 두 번 1.3.10-1.3.11 단계를 반복합니다. 모든 용출액을 풀. 4 ℃에서 10,000 XG에서 원심 분리하여 원심 분리 필터 장치 (10 kDa의 명목 분자량 한계 컷 – 오프 PES) 아래로 25 μL로 용출액을 농축시킨다. 새로운 냉각 튜브에 집중 용출액을 전송하고 50 % glyce를 추가5 %의 최종 농도 ROL. 필요한 경우 농축 용출액을 밤새 4 ℃에서 유지 될 수있다. 2. 블루 기본 페이지 준비 1 배 기본 페이지 양극 버퍼, 1X 기본 PAGE 다크 블루 음극 버퍼 및 1X 기본 페이지 라이트 블루 음극 버퍼 1 L를 준비합니다. 프리 캐스트 3~12% 기본 PAGE 젤의 빗을 제거하고 1X 기본 PAGE 다크 블루 음극 버퍼로 두 번 우물을 씻는다. 1 배 기본 PAGE 다크 블루 음극 버퍼로 우물을 채 웁니다. 실행중인 탱크의 젤을 설정하지만, 음극 (내부) 챔버에 다크 블루 음극 버퍼를 추가하지 마십시오. 전기 실행 샘플 준비 : 1X 용출액 각각 최종 농도 0.005 %에 해당 네이티브 4X 샘플 로딩 버퍼의 부피는 0.5 %의 G-250 샘플을 추가 첨가제 농축 25 μL한다. betwee 빈 우물을 떠나 샘플 및 네이티브 분자량 마커를로드를 n 개. 모든 빈 우물에 1 배 기본 샘플 로딩 버퍼의 부하 10 ~ 20 μL. 샘플을 방해하지 않도록주의 1 배 기본 PAGE 다크 블루 음극 버퍼의 200 mL를 음극 (내부) 챔버를 입력합니다. 1X 천연 PAGE 양극 완충액 550 mL를 애노드 (외부) 챔버를 채운다. 30 분, 150 V에서 젤을 실행. , 실행을 중지하고 혈청 학적 피펫 다크 블루 음극 버퍼를 제거하고 1 배 라이트 블루 음극 버퍼로 교체합니다. 60 분의 실행을 계속합니다. 겔 C 실온 또는 4 ℃에서 실행될 수있다; 온도는 단백질의 복잡한 구조에 영향을 미칠 수 있습니다. 젤 염색 겔 카세트를 열고 카세트 판을 버린다. 겔은 다른 카세트 판에 부착 된 상태로 유지. 겔을 포함하고 온화한 진탕하면서 30 분 동안 배양 충분한 정착 용액 (40 % 메탄올, 2 % 아세트산)을 함유 한 트레이나 용기에 겔을 전송. 정착액 오디오 솔루션을 제거이온 겔을 커버하기에 충분한 물을 첨가 하였다. 젤은 향후 참조를 위해 스캔 할 수 있습니다. 3. 질량 분광법 분석 주의 : 샘플의 청결을 위해 가능한 모든 후속 단계는 층류 후드에서 수행되어야한다. 모든 솔루션은 HPLC 등급의 물을 준비해야합니다. 분석을 수행 할 질량 분석 실험실이 프로토콜을 토론한다. 준비 폐기물을 수집하는 다른 96- 웰 플레이트 위에 원추형 바닥 96 웰 플레이트를 놓는다. 피어스 21 G 바늘 원추형 바닥 96 웰 플레이트의 웰의 바닥. 주입 투과 96- 웰 플레이트의 웰을 세척한다. 주입 투과 판의 웰에 50 % 아세토 니트릴 – 0.25 % 포름산 200 μL를 추가한다. 10 분 동안 진탕 기에서 플레이트를 인큐베이션 스택. 1 분 동안 500 XG에서 원심 분리되도록 액체 폐기물 수집 플레이트에 구멍을 통해 흐른다. 승 폐기ASTE 액체. 단계를 반복 3.1.2.1-3.1.2.2 두 번 더. 50mM의 중탄산 암모늄 150 μL와 관통 96 웰 플레이트 채우기 (갓). 원심 여과를 96- 웰 플레이트의 웰을 세척한다. 폐기물 수집 원심 여과 판 하에서 통상 96 웰 플레이트를 놓는다. 원심 여과 플레이트의 각 웰에 50 % 아세토 니트릴 – 0.25 % 포름산 200 μL를 추가한다. 1 분 동안 200 XG에 판 스택 원심 분리기. 폐기물을 폐기하십시오. 단계를 반복 3.1.3.1-3.1.3.2 두 번 더. 젤 절제와 인 – 젤 소화 참고 : 젤을 절개하는 동안, 식별 및 단백질 표준의 각 정렬 겔 슬라이스를 기록합니다. 단백질 표준은 모든 젤 슬라이스에 대한 대략적인 분자량을 추정하는 데 사용할 수 있습니다. 깨끗한 표면에 유리판 겔을 놓는다. 차선에 포함 슬라이스동일한 48 개 조각 (1.5 mm × 5 mm)로 샘플을 보내고. (겔의 맨 마지막 5 개 조각은 제외) 2-3 작은 조각으로 각각의 조각으로 절단하고 피어싱의 한 웰에 각 조각을 순차적으로 배치하고 96- 웰 플레이트를 세척 하였다. 각 웰에 아세토 니트릴 50 μL를 추가합니다. 30-60 분 동안 진탕 플레이트를 인큐베이션. 단계 3.1.2.2에서와 같이 원심 분리하여 액체를 제거합니다. 각 웰의 50 mM 중탄산 암모늄의 2 밀리미터 TCEP 200 μL를 추가한다. 30 분 동안 실온에서 진탕하면서 인큐베이션 플레이트. 단계 3.1.2.2에서와 같이 원심 분리하여 액체를 제거합니다. 각 웰의 50 mM 중탄산 암모늄의 요오도 아세트 아미드 4 mm 인 200 μL를 추가한다. 어둠 속에서 37 ° C에서 30 분 동안 진탕 플레이트를 인큐베이션. 단계 3.1.2.2에서와 같이 원심 분리하여 액체를 제거합니다. 50mM의 중탄산 암모늄 150 μL 플러스 아세토 니트릴의 50 μL를 추가하고 실온에서 30 분 동안 진탕 배양 플레이트. 이 세척 단계 A를 반복모든 블루 색상이 젤 조각에서 제거 될 때까지 필요에 따라 여러 번이야. 순수 아세토 니트릴 200 μL를 첨가하여 겔 조각 탈수 겔 조각 백색 불투명 할 때까지 20 분 동안 실온에서 진탕 배양한다. 아세토 니트릴을 제거합니다. 각 웰에 차가운 50mM의 중탄산 암모늄 0.001 밀리그램 / ㎖의 트립신 (시퀀싱 등급) 150 μL를 추가한다. 2 시간 동안 37 ° C에서 진탕 플레이트를 인큐베이션. 1 시간 후, 젤 조각은 액체로 덮여 있음을 확인; 그렇지 않은 경우의 50 mM 중탄산 암모늄의 다른 50-100 μL를 추가한다. 37 ° C에서 2 시간 후, 밤새 25 ℃에서의 분해를 계속한다. 플레이트의 정확한 방향을 보장 겔 함유 플레이트 하에서 깨끗한 원추형 바닥 판을 놓는다. 1 분 동안 200 XG에서 원심 분리에 의해 펩타이드를 함유하는 액체를 수집한다. 원심 증발기에서 펩티드 – 함유 플레이트를 놓고 t를 수행하는 동안, 액체를 증발그는 다음 단계. 겔 조각을 50 % 아세토 니트릴 – 0.25 % 포름산 150 μL를 추가한다. 30 분 동안 37 ℃에서 진탕하면서 인큐베이션. 1 분 동안 200 XG에서 원심 분리 단계 3.2.9에서 부분적으로 건조 된 플레이트에 액체를 수집한다. 다음 단계를 수행하는 동안 펩티드 – 함유 플레이트를 증발 계속. 반복 3.2.10-3.2.11 단계를 반복합니다. 겔 조각을 포함하고있는 플레이트의 각 웰에 순수 아세토 니트릴 200 μL를 추가한다. 15 분 동안 실온에서 진탕하면서 인큐베이션. 1 분 동안 200 XG에서 원심 분리에 의해 펩티드 – 함유 플레이트에 액체를 수집한다. 모든 우물에서 아세토 니트릴의 최종 농도가 55 % 이상인지 확인합니다. 필요한 경우, 여분의 순수 아세토 니트릴을 추가합니다. 세정, 원심 여과 판 펩티드 용액을 전송. 펩티드를 수집하여 그 아래 깨끗한 원추형 바닥 판을 놓는다. 1 분 동안 200 XG에 판 스택 원심 분리기. 에바웰이 완전히 건조 될 때까지 원추형 바닥 판에 액체를 먹었다. 플레이트는 실리콘 덮개 피복 단계에서 -20 ℃에서 저장 될 수있다. 격렬하게 15 분 동안 진탕 0.5 % 포름산 32 μL의 펩티드를 재용. 400 mM의 중탄산 암모늄 8 μL를 첨가하고 격렬하게 15 분 동안 진탕 배양한다. 1 분 동안 200 XG에 플레이트를 원심 분리기. 실리콘 뚜껑을 덮고, 질량 스펙트럼 분석까지 -20 ℃에서 플레이트를 저장한다. 질량 분석 참고 : 샷건 프로테오믹스 (proteomics)와 호환 방법을 사용하여 고해상도 질량 분석기에 펩티드를 분석합니다. 데이터 종속 취득 이러한 유형의 분석을 위해 가장 일반적으로 사용되는 MS가 설정 LC-탠덤이며, 배경 잡음 위에 중복 서열과 후보 선택을 최소화 펩티드 효율적인 식별을 위해 최적화되어야한다. 제 1 단계 질량 분석 검사 (MS1) 질량 스펙트럼 프로파일 모드로 기록되어야한다. 그것은 추천입니다ED 우선적 두번째 단계 질량 분석 (MS2)에 대한 이중 및 삼중 하전 된 이온을 선택한다. m / z 400-1,600의 질량 범위는 8-30 아미노산 범위 사이에서 가장 펩티드를 확인하기에 적합하다. 여기서, Orbitrap 질량 분광계를 사용하여 분석을위한 프로토콜이 제공된다. nanoLC-MS / MS 시스템의 오토 샘플러를 사용하여 분석 당 20 μL의 시료를 주입한다. C18 컬럼 (100 μm의 ID, 2cm)을 탈염 및 역상 펩티드에 집중. 300 거리 nL / min으로 4-28 % 아세토 니트릴 / 0.1 % 포름산 30 분 선형 구배를 이용한 분석 C18 컬럼 (75 μm의 ID, 15cm)에서 분리 된 펩타이드. 다음과 같은 파라미터를 가진 10 가지의 데이터 종속 취득 방법과 질량 분석기에서 펩타이드를 분석 : m / z 범위 380-1,600, m의 해상도 30,000 / z 400, 2 목 단리 폭 45 s의 ± 10 ppm에서 동적 제외 자동 이득 제어 대상 MS / MS, 최대 분사 시간 1 X MS 10 6 5000에서 MS에 대한 MS (150) 및MS / MS 100 MS. 4. 데이터 분석 MaxQuant를 사용하여 단백질 식별 및 정량화 질량 분석 원시 데이터로부터 각 겔 분율에 단백질을 식별하고 정량화하기 위해 자유롭게 사용할 수 MaxQuant 소프트웨어를 사용합니다. 참고 : MaxQuant 데이터에 의존 수집 샷건 프로테오믹스 방법에 의해 생성 된 데이터에서 작동합니다. 청색 네이티브 겔 분획으로부터 MS 데이터는 별도의 실험뿐만 아니라 모든 겔 조각을 조합 한 실험의 분획으로서 일괄 적으로 해석되어야한다. 화학 양론 계산을 수행 할 수 iBAQ 값 확인란을 선택합니다. MaxQuant를 이용하여 데이터베이스 검색 및 단백질 정량 상세한 프로토콜은, (22) (21)에 기재되어있다. 페르세우스를 사용하여 단백질의 프로파일 분석 확인 된 단백질의 이동 프로파일을 표시하기 위해 자유롭게 사용 가능한 소프트웨어 페르세우스를 사용하여 사용하여 비교통계 분석. 참고 : 페르세우스를 사용하는 방법에 대한 일반 문서는 http://www.coxdocs.org/doku.php?id=perseus:user:tutorials에서 확인할 수있다. 샘플 데이터 세트는 보충 자료로 사용할 수 있습니다. 모든 젤 분수의 단백질 식별 및 정량 값을 포함하는 MaxQuant 분석에 의해 반환 된 proteingroups.txt 파일을 업로드합니다. 메인 상자 (그림 1)에 강도 값을 채 웁니다. 행렬는 열로서 겔 분율과, 행에있는 모든 단백질을 포함하는 식별 표시한다. 히트 역에 대응하는 엔트리만을 필터 로우 드롭 다운 메뉴의 범주 열을 기반으로 필터 열 (도 2)을 선택하여 위치 및 잠재적 오염에 의해 식별 된 단백질을 제거한다. 그 후, 평준화 드롭 다운 메뉴에서 합계 (도 3) 분할을 선택하여 총 단백질 강도 프로파일에 대하여 각각 전체 단백질의 분획 농도를 정상화. 새로운 mATRIX가 나타납니다. 시각화 드롭 다운 메뉴 (도 4) 프로필 플롯을 선택하여 모든 단백질의 이동 프로파일의 플롯을 보여준다. 필터 행 드롭 다운 메뉴에서 유효 값을 기준으로 필터링을 선택합니다 행. 필요한 유효한 값의 수에 1을 입력합니다. 클러스터링 / PCA 드롭 다운 메뉴에서 계층 적 클러스터링을 선택하여 모든 블루 기본 젤 분수에서 확인 된 단백질의 계층 적 클러스터링을 수행합니다. 열 나무 상자 (그림 5)의 선택을 취소합니다. 클러스터는 다음의 매트릭스 (도 6)으로 클러스터링 탭에서 열지도 시각화된다. dendrogram은의 미끼 단백질을 포함하는 클러스터를 찾습니다. 클러스터의 다른 구성 요소는 미끼와 공동 이주 단백질을 나타내며, 따라서 동일한 복합체의 잠재적 상호 작용 단백질 / 서브 유닛이다. <b r /> 그림 페르세우스 데이터 업로드 창 1. 스크린 샷. 도면은 페르세우스으로 단백질 확인 및 정량 데이터를 로딩하는 단계를 도시한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 사이트 식별 안타 단백질을 역 오염에 대응하는 항목의 필터링 페르세우스 창 2. 스크린 도표. 범주 열을 기준으로 필터 행을 선택하면 단백질 항목의 유형을 선택할 수있는 새 창이 데이터 세트에서 제거 할 열립니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. /55498fig3.jpg "/> 페르세우스 정규화 창 3. 스크린 샷 그림. 정상화 메뉴에서 나누기를 선택하면 다른 옵션으로 새 창을 엽니 다. 합계를 선택하면 모든 분획에 걸쳐 그 단백질의 전체 강도에 의해 각 분획의 단백질의 강도 값을 나눈다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 페르세우스 이주 프로파일의 플롯을 나타낸도 4의 스크린 샷. 단백질은 해당 프로파일을 강조하는 프로파일 아래 행렬에서 선택 될 수있다. 이 도구 모음은 프로파일을 편집하고 수출하는 데 사용할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <p class="jove_content" fo:유지-together.within 페이지 = "항상"> 페르세우스 계층 적 클러스터링 창 5. 스크린 샷 그림. 도면은 맨해튼 (L1)의 거리 메트릭을 사용하여 단백질의 클러스터링 계층의 설정을 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 페르세우스도 6의 스크린 샷 Dendrogram이 단백질 농도 히트 맵을 도시. 메인 패널의 오른쪽에있는 작업 흐름은 단계마다 수행하고, 생성 행렬을 나타내며, 임의의 단계를 취소 할 수있다. 워크 플로우는 중간 행렬로부터 분기 할 수있다. 이 F의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오igure. 상대 화학량 론의 계산 미끼 단백질과의 공동 클러스터링 기반으로하는 단백질 복합체의 서브 유닛을 선택하고 나타나는 프로파일 피크 (들)을 구분합니다. 각 분획에 대한 각 서브 유닛 MaxQuant 분석 iBAQ 반환 값을 개별적으로 사용하여 그 부분에 대응하는 미끼 iBAQ 값으로 정규화. 선택된 피크 분획에 걸쳐 미끼 단백질 소단위 복합체에 대한 정규화 iBAQs 플롯 선형 회귀를 적용한다. 그 정규화 iBAQ 값의 추이를 비교하여 미끼 복잡한 서브 유닛의 상대적 양을 계산한다. 단백질 복잡한 크기의 추정 샘플 차선에서 정렬 블루 기본 젤 조각에 대한 예측 분자량을 계산하는 단백질 표준을 사용합니다. 이들로부터, y를 이동시킴으로써 행한다에서 겔은 X시킴으로써 행한다 슬라이스 및 분자량 플롯하여 선형 회귀 모델을 생성한다. </lI> 가 확인 된에서 파란색 기본 슬라이스 (들)에 따라 단백질 복합체 (들)의 관찰 분자량 범위를 추정하는 모델을 사용합니다.