ブルーネイティブPAGEおよびタンパク質相関プロファイリングによってアフィニティー精製タンパク質複合体の解決

FLAGアフィニティー精製によりネイティブのタンパク質複合体の単離準備細胞ペレットを解凍するために37°Cの水浴を設定します。 4°Cに微量をクールダウン。 異なるサイズのいくつかのマイクロ遠心チューブ（1.5 mLを、15 mL）に溶解し、氷中でホモジナイザーを置きます。 溶解緩衝液（50mMのトリス-HCl pHが8、150mMのNaCl、0.1％ノニデットP-40、1mMのEDTA）を10mLを調製し、氷上で保管。直前のバッファを使用して、10 1 M DTTのμLとEDTAフリープロテアーゼ阻害剤の破砕タブレットを追加します。 抗体結合ビーズの調製注：抗体でコーティングされたビーズは、事前に週まで用意し、必要になるまで冷蔵庫に保管することができます。プロテインGは、プロテインAは、より高い親和性を持っているウサギIgGを除き、サブタイプ免疫グロブリンほとんどの種のためのプロテインAよりも高い親和性を有します。 転送50：プロテインGでコーティングされた磁気ビーズの50μLを洗います＃956;微量遠心管にビーズスラリーのLは、チューブの側面にビーズを収集し、液体を除去するために、磁石チューブを置きます。 PBS-0.01％Tween-20を0.5mLの中でビーズを再懸濁します。 チューブの側面にビーズを収集し、液体を除去するために、磁石チューブを置き。 PBS-0.01％Tween-20を40μL中でビーズを再懸濁します。 M2抗FLAG抗体を10μg（1mg / mlのストック溶液の10μL）を加えます。室温で20分間回転させながらインキュベートします。 チューブの側面にビーズを収集し、液体を除去するために、磁石チューブを置き。 PBS-0.01％Tween-20を0.5mLでビーズを洗浄します。 ビーズに抗体を架橋するために、0.2 MトリエタノールアミンpHを8.2 1mLで二回ビーズを洗浄します。次いで、0.2 MトリエタノールアミンpHは8.2で20mMのDMP（ジメチルピメリミデート）（DMP溶液は使用直前に新たに調製すべきである）1mLにビーズを再懸濁します。室温で30分間回転させながらインキュベートします。 </LI> 磁石にチューブを置きます。上清を除去し、50mMトリス-HCl pH7.5の0.5mLの中でビーズを再懸濁します。室温で15分間回転させながらインキュベートします。 PBS-0.1％Tween-20を0.5mLでビーズを3回洗浄します。必要になるまで最後の洗浄中にビーズを残します。 FLAGベースのアフィニティ精製注：長時間のバッファなしでビーズを残さないで注意してください。すべてのバッファチューブは常に氷上に保管してください。以下のプロトコルは、FLAGタグタンパク質20の内因性レベルを発現2-5×10 8個の細胞からのタンパク質複合体の精製（10-20 mgのタンパク質溶解物）のために最適化されています。 それが溶け始めるまで37℃の水浴中で細胞ペレットを解凍します。 、浴からチューブを取り、ペレットが完全に解凍されるまで、ゆっくりと旋回し、すぐに氷の上で細胞懸濁液の入ったチューブを配置します。 氷冷溶解緩衝液5 mLを加え混合する細胞懸濁液と渦に（DTTおよびプロテアーゼ阻害剤を含有します）。 10分間氷上でインキュベートします。 冷たいダウンスホモジナイザーにライセートを移します。 （目立った粘度がなくなるまで）タイト乳棒を用いて20〜30ストロークで溶解します。冷たいマイクロ遠心チューブにホモジネートを転送します。 4°Cで15分間18,000×gで遠心分離。 きれいな冷たいチューブに清澄化ライセートを転送します。背後の溶解物50μLを残します。タンパク質濃度を測定し、精製を監視するために、溶解物の35μLアリコートを取ります。 ビーズからPBS-0.1％のTween-20を取り除きます。溶解液1mLでビーズを再懸濁し、溶解物の残りと混合します。 1〜2時間4℃で回転ホイールで混合物をインキュベートします。 マグネット付チューブの側面にビーズを収集します。上清の30μLアリコートを収集し、上清の残りを捨てます。 IPP150緩衝液（10mMトリス-HCl pHが8、15の0.5 mL中にビーズを再懸濁0のNaCl、1mMのEDTA、0.1％NP-40）4-6回ピペッティングすることによって。 1.5 mLの冷チューブに移します。 IPP150バッファー0.5mLのさらに2回洗浄を繰り返します。 洗浄は、FLAGネイティブ溶出緩衝液（20mMのビス – トリスpHは7、20のNaCl、0.02％ノニデットP-40、1mMのEDTA、200mMのεアミノカプロン酸）0.5mLで3回ビーズ。最後の洗浄では、新しい冷たいチューブにビーズを移します。徹底的にバッファを削除します。 ネイティブ溶出緩衝液中の200μg/ mLの3×FLAGペプチドの100μL中にビーズを再懸濁します。穏やかに回転させながら10分間4℃でインキュベートします。 磁石でビーズを収集し、冷たい上清を新しいチューブに移します。 繰り返して、二回1.3.10-1.3.11を繰り返します。すべての溶出液をプール。 4℃、10,000×gでの遠心分離によって遠心フィルターユニット25μL（10 kDaの公称分子量限界カットオフ、PES）まで溶出液を濃縮します。新しい冷たいチューブに濃縮し、溶出液を移し、50％のglyceを追加5％の最終濃度のためのROL。必要に応じて、濃縮溶出物を4℃で一晩保持することができます。 2.ブルーネイティブPAGE 準備 1xのネイティブPAGE陽極バッファーの1 L、1×ネイティブPAGEダークブルー陰極バッファおよび1xのネイティブPAGEライトブルー陰極バッファを準備します。 プレキャスト3から12パーセントのネイティブPAGEゲルの櫛を削除し、1×ネイティブPAGEダークブルー陰極バッファーでウェルを2回洗います。 1xのネイティブPAGEダークブルー陰極バッファーで井戸を埋めます。ランニングタンク内のゲルを設定しますが、陰極（内側）室にダークブルー陰極バッファを追加しないでください。 電気泳動の実行サンプルを調製する：〜25μLの溶出液は、それぞれ4×ネイティブサンプルローディング緩衝液及び1X及び0.005％の最終濃度0.5％G-250サンプルの添加剤の適切な量を追加し、濃縮しました。 betwee空のウェルを残しサンプルネイティブ分子量マーカーをロードそれらをn個。すべての空のウェル中、1×ネイティブサンプルローディングバッファーの負荷10〜20μL。 サンプルを邪魔しないように慎重に1xのネイティブPAGEダークブルー陰極バッファー200mlで陰極（内側）チャンバーを埋めます。 1XネイティブPAGE陽極緩衝液550 mlを陽極（外側）チャンバを満たします。 30分間、150Vでゲルを実行します。実行を停止し、血清ピペットとダークブルー陰極バッファを削除し、1×ライトブルー陰極バッファーと交換してください。 60分間の実行を続行します。ゲルは、室温または4℃で実行することができます。温度は、タンパク質複合体の構造に影響を与える可能性があります。 ゲル染色ゲルカセットを開き、カセットプレートのいずれかを破棄する。ゲルは、他のカセットプレートに取り付けられたままです。ゲルをカバーし、穏やかに振盪しながら30分間インキュベートするのに十分な固定液（40％メタノール、2％酢酸）を含有するトレイまたは容器にゲルを移します。 固定solutを削除イオンとゲルをカバーするために十分な水を追加します。ゲルは、将来の参考のためにスキャンすることができます。 3.質量分析注：サンプルの清浄度を確保することができる場合は、すべてのその後の工程は、層流フード内で行われるべきです。すべてのソリューションは、HPLCグレードの水を用いて調製されなければなりません。分析を実施します質量分析研究室でこのプロトコルを話し合います。 準備廃棄物を収集するために別の96ウェルプレートの頂部に円錐状の底96ウェルプレートを置き。ピアス21 G針を有する円錐底96ウェルプレートのウェルの底。 ピアス96ウェルプレートのウェルを洗浄します。 穿孔プレートのウェルに、50％アセトニトリル、0.25％ギ酸の200μLを加えます。 10分間シェーカーでプレートスタックをインキュベートします。 1分間500×gで遠心分離液は廃棄物収集プレート内の穴を通って流れるようになっています。ワットを破棄ASTEの液体。 手順を繰り返します3.1.2.1-3.1.2.2さらに2回。 50mMの炭酸水素アンモニウム150μlでピアス96ウェルプレートのウェルを充填する（たて）。 遠心ろ過、96ウェルプレートのウェルを洗浄します。 廃棄物を収集するために遠心濾過板の下、通常の96ウェルプレートを置きます。遠心濾過プレートの各ウェルに50％アセトニトリル、0.25％ギ酸の200μLを加えます。 1分間200×gでプレートスタックを遠心。廃棄物を捨てます。 手順を繰り返します3.1.3.1-3.1.3.2さらに2回。 ジェル切除およびゲル内消化注：ゲルを切り出し一方で、特定し、タンパク質標準のそれぞれに合わせゲルスライスをメモします。タンパク質標準は、すべてのゲルスライスのおおよその分子量を推定するために使用することができます。 清浄な表面上のガラス板を有するゲルを置き。含まれているレーンをスライス48枚の同じスライス（1.5ミリメートル×5ミリメートル）に試料をする。 （ゲルの上部の最後の5つのスライスを除く）2-3小片に各スライスをカットし、ピアスの1つのウェル中の各スライスを順次配置し、96ウェルプレートを洗浄しました。 各ウェルにアセトニトリル50μLを追加します。 30〜60分間振盪しながらプレートをインキュベートします。ステップ3.1.2.2のように遠心分離によって液体を除去します。 各ウェルに50mMの重炭酸アンモニウムで2 mMのTCEPの200μLを加えます。室温で30分間振盪しながらプレートをインキュベートします。ステップ3.1.2.2のように遠心分離によって液体を除去します。 各ウェルに50mMの炭酸水素アンモニウムでヨードアセトアミド4ミリの200μLを加えます。暗所で37℃で30分間振盪しながらプレートをインキュベートします。ステップ3.1.2.2のように遠心分離によって液体を除去します。 50mMの重炭酸アンモニウムを加え、アセトニトリルの50μLの150μLを加え、室温で30分間振盪しながらプレートをインキュベートします。この洗浄工程aを繰り返します全て青色がゲル片から除去されるまで、必要に応じて何回です。 純粋アセトニトリル200μLを添加することにより、ゲル片を脱水し、ゲル片は、白色不透明になるまで20分間室温で振盪しながらインキュベートします。アセトニトリルを除去します。 各ウェルに冷50mM重炭酸アンモニウム中のトリプシンの0.001 mg / mlと（シーケンシンググレード）の150μLを加えます。 2時間37℃で振盪しながらプレートをインキュベートします。 1時間後、ゲル片が液体で覆われていることを確認。そうでない場合、50mMの炭酸水素アンモニウムの別の50-100μLを加えます。 37℃で2時間後、25℃で一晩消化し続けます。 プレートの正しい向きを確保する、ゲル含有プレートの下に清浄なコニカル底板を置き。 1分間200×gで遠心分離することによりペプチドを含有する液体を集めます。 遠心蒸発器でペプチド含有プレートを配置し、Tを実行しながら、液体を蒸発させます彼の次のステップ。 ゲル片を50％アセトニトリル、0.25％ギ酸の150μLを加えます。 37℃で30分間振盪しながらインキュベートします。 1分間200×gで遠心分離することによって、ステップ3.2.9から部分的に乾燥したプレートに液体を集めます。次のステップを実行しながら、ペプチド含有プレートを蒸発させ続けます。 繰り返して3.2.10-3.2.11を繰り返します。 ゲル片を含むプレートの各ウェルに純粋アセトニトリル200μLを加えます。 15分間室温で振盪しながらインキュベートします。 1分間200×gで遠心分離によってペプチド含有プレートに液体を集めます。 すべてのウェル中のアセトニトリルの最終濃度が55％を超えていることを確認してください。必要に応じて、余分な純粋なアセトニトリルを追加します。 洗浄後、遠心濾過プレートにペプチド溶液を移します。ペプチドを収集するためにその下に清浄な円錐底板を置き。 1分間200×gでプレートスタックを遠心。 Evaporウェルが完全に乾燥するまで円錐状底板に液体を食べました。プレートは、シリコーン蓋で覆い、この段階で-20℃で保存することができます。 激しく15分間振とうしながら、0.5％ギ酸の32μLでペプチドを再溶解させます。 400mMの重炭酸アンモニウムの8μLを添加し、15分間激しく振盪しながらインキュベートします。 1分間200×gでプレートを遠心します。シリコーン蓋で覆い、質量分析まで-20℃でプレートを格納します。 質量分析注：ショットガンプロテオミクスと互換性のある方法を使用して、高分解能質量分析計でペプチドを分析します。データ依存取得は、最も一般的に使用されるLCタンデムMSは、このタイプの分析のためにアップを設定し、効率的なペプチドの同定のために最適化されるべき、バックグラウンドノイズ上の冗長配列決定し、候補選択を最小化です。第一段階質量分析スキャン（MS1）にマススペクトルは、プロファイルモードで記録されなければなりません。これはお勧めですEDは、優先第二段階質量分析（MS2）のための二重及び三重荷電イオンを選択します。 M / Z 400-1,600の質量範囲は、8〜30個のアミノ酸の範囲の間で最もペプチドを同定するのに適しています。ここで、オービトラップ質量分析計を用いて分析するためのプロトコルが提供されます。 ナノLC-MS / MSシステムのオートサンプラーを使用して分析当たりのサンプル20μLを注入します。脱塩し、逆相C18カラム（100μM番号2 cm）の上にペプチドを濃縮します。 300 NL / minで4から28までパーセントアセトニトリル/ 0.1％ギ酸の30分間の直線勾配を用いて分析C18カラム（75μmのID 15 cm）の上の別個のペプチド。 M / z範囲380-1,600、M / Z 400において分解能30,000 2のTh、45秒間±10 ppmの動的排除の分離幅：次のパラメータを使用して依存取得方法トップ10のデータと質量分析計でペプチドを解析、1×10 MS 6およびMS / MSのための5,000で自動利得制御対象、最大噴射時間MS 150のMSおよびMS / MSのために100ミリ。 4.データ解析 MaxQuantを用いてタンパク質の同定および定量質量分析生データから各ゲル分中のタンパク質を同定および定量するために自由に利用できるMaxQuantソフトウェアを使用します。 注：MaxQuantは、データ依存取得ショットガンプロテオミクスアプローチによって生成されたデータ上で動作します。ブルーネイティブゲル画分からMSデータは、すべてのゲルスライスを組み合わせ実験の画分として別々の実験としないようにバッチで分析すべきです。化学量論計算を実行するためにiBAQ値ボックスにチェックを入れます。 MaxQuantを使用してデータベース検索およびタンパク質定量のための詳細なプロトコルは、22 21に記載されています。 ペルセウスを用いたタンパク質プロファイル分析同定されたタンパク質の移動プロファイルを表示するために自由に利用できるソフトウェアペルセウスを使用し、使用してそれらを比較統計分析。 注：ペルセウスを使用する方法に関する一般的なドキュメントはhttp://www.coxdocs.org/doku.php?id=perseus:user:tutorialsで入手できます。サンプルデータセットは、補足データとして利用可能です。 すべてのゲル画分についてのタンパク質同定および定量値を含むMaxQuant分析によって返さproteingroups.txtファイルをアップロードします。メインボックス（ 図1）に強度値を取り込みます。行列は、列としてゲル分率と、行の全てのタンパク質の同定を含むが表示されます。 ヒットを逆に対応するエントリ、唯一のフィルター行のドロップダウンメニューでカテゴリの列（ 図2）に基づいてフィルタの行を選択することで、サイトや潜在的な汚染物質によって同定されたタンパク質を除去します。 次に、正規化ドロップダウンメニューの合計（ 図3）分割を選択することによって、総タンパク質に対する強度プロファイルを横切る各タンパク質の画分の強度を正規化します。新しいメートルATRIXが表示されます。 可視ドロップダウンメニュー（ 図4）内のプロファイルプロットを選択することによって、全てのタンパク質の移行プロファイルプロットを表示します。 フィルター行のドロップダウンメニューで有効な値に基づいてフィルタの行を選択します。必要な有効な値の数に1を入力します。 クラスタリング/ PCA]ドロップダウンメニューで階層的クラスタリングを選択することで、すべての青ネイティブゲル画分間同定されたタンパク質の階層的クラスタリングを実行します。列の木箱（ 図5）をオフにします。クラスターは次の行列にクラスタリングタブのヒートマップ（ 図6）に可視化されます。 系統樹でベイトタンパク質を含むクラスタを探します。クラスタの他の成分は、餌と同時移行タンパク質を表し、したがって、同複合体の潜在的相互作用タンパク質/サブユニットです。 <b ペルセウスデータアップロードウィンドウの r /> 図1のスクリーンショット。図はペルセウスにタンパク質同定および定量データをロードするための手順を示しています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 サイトによって同定されたヒットとタンパク質を逆に、汚染物質に対応するエントリのフィルタリングにペルセウスウィンドウのスクリーンショット2.図。カテゴリ列によってフィルター行を選択すると、データセットから排除されるべきタンパク質のエントリの種類を選択するための新しいウィンドウが開きます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 /55498fig3.jpg」/> ペルセウス正規化ウィンドウの3スクリーンショット図。正規のメニューで分割を選択すると、さまざまなオプションと、新しいウィンドウが開きます。合計を選択すると、すべての画分を横切ってそのタンパク質の合計強度によって各画分中のタンパク質の強度値を分割します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 ペルセウスは、移行プロファイルのプロットを示す図4.スクリーンショット。タンパク質は、それらの対応するプロファイルを強調するためのプロファイル以下のマトリックスに選択することができます。ツールバーには、プロファイルを編集してエクスポートするために使用することができます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <p class="jove_content" fo:キープtogether.withinページ="「常に」"> ペルセウス階層的クラスタリング・ウィンドウのスクリーンショット5.図。図は、マンハッタン（L1）の距離メトリックを使用して、タンパク質の階層的クラスタリングの設定を示しています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 ペルセウスの図6のスクリーンショットは、デンドログラムとタンパク質強度ヒートマップを示します。メインパネルの右側のワークフローは、各ステップ実施し、得られた行列を示し、任意のステップを取り消すために使用することができます。ワークフローはまた、任意の中間行列から分岐することができます。 このFの拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。igure。 相対的化学量論の計算ベイトタンパク質との共クラスタリングに基づいたタンパク質複合体のサブユニットを選択し、それらが表示されるプロファイルのピーク（複数可）を区切ります。 各画分中の各サブユニットのためMaxQuant分析によって返さiBAQ値を別々に使用して、その画分の対応するベイトiBAQ値により正規化。 選択されたピークの画分を横切っベイト及びタンパク質複合体のサブユニットの正規化iBAQsをプロットし、線形回帰を適用します。その正規iBAQ値の傾向を比較することによって、餌する複合体サブユニットの相対量を計算します。 タンパク質複合体の大きさの推定サンプルレーンから整列ブルーネイティブゲルスライスの予測分子量を計算するためにタンパク質標準を使用します。これらのことから、Y軸 -軸にx軸および分子量でゲルスライスをプロットし、線形回帰モデルを生成します。 </lI> それらが同定され、そこから青色ネイティブスライス（複数可）に基づいて、タンパク質複合体（単数または複数）の観察された分子量範囲を推定するためにモデルを使用します。