Enzimatik olarak aktif G4 Resolvase1 saflaştırılması için bir G-dörtlüsü DNA eğilim yaklaşım
Summary
G4 Resolvase1 G4-bağlama proteini için dar bildirilen afinite ile G-dörtlüsü (G4) yapılara bağlanan ve HeLa hücreleri G4-DNA ayırma aktivitesinin çoğunluğunu temsil eder. Biz özellikle, katalitik olarak aktif yeniden birleştirici G4R1 saflaştırmak için afinite ve G4 Resolvase1 ATP'ye bağımlı açma aktivitesi koşum yeni bir protokol açıklar.
Abstract
Yüksek mertebeden DNA'nın yapısı hem DNA ve RNA guanin zengini bölgelerde oluşabilir G-quadruplexes (G4s, G4 yapılar) olarak adlandırılan ve son derece termal stabildir. Orada, insan genomunda> 375.000 putatif G4-oluşturucu dizileri vardır ve bunlar promoter bölümleri, çevrilmemiş bölgeleri (UTRs) 'de zenginleştirilmiştir ve telomerik tekrarlama olan. Nedeniyle bu yapıları replikasyon ve transkripsiyon gibi hücresel süreçleri etkileyecek potansiyeli, hücre onları yönetmek için enzimler gelişti. Böyle bir enzim, biyokimyasal ve laboratuar Nagamine ve arkadaşları tarafından ortaklaşa karakterize G4 resolvaz 1 (G4R1) 'dir. ve son derece sıkı bir şekilde (düşük uM aralığında Kd) her iki G4 DNA ve G4-RNA bağlanma bulundu. G4R1 HeLa hücre lizatlarında G4 çözme aktivitesinin çoğunun nedeni bu yana telomer metabolizması, lenf geliştirme, gen transkripsiyonu, hematopoiezin ve bağışıklık takibinde rol oynadığı işaret edilmiştir. ef becerisificiently ifade ve katalitik olarak aktif G4R1 G4 yapıları ve G4-çözme enzimlerin kinetik etkileşim içine daha fazla anlamada ilgilenen laboratuarlar için önem taşımaktadır arındırmak. Burada, rekombinant G4R1 (rG4R1) saflaştırılması için ayrıntılı bir yöntemi açıklanmaktadır. anlatılan prosedür, bir C-terminali histidin etiketli enzim geleneksel afinite bazlı saflaştırma bağlanan ve bir ATP son derece aktif enzim saflaştırmak için G4 DNA gevşemeye rG4R1 yeteneğinin kullanımı ile insan kodon optimize bakterilerde ifade kapsar bağımlı elüsyon adımı. protokol, rG4R1 enzimatik aktivitesi G4 DNA gevşemeye saflaştınlmış enzim yeteneği incelenerek ölçüldüğü bir kalite kontrol adımı içerir. Bir yöntem olup saflaştırılmış rG4R1 ölçümü sağlar tanımlanmaktadır. Bu protokolün alternatif uyarlamaları tartışılır.
Introduction
G4 yapılar DNA ve RNA'nın guanin zengini bölgeler içinde formu son derece kararlı bir nükleik asit ikincil yapılardır. G4 yapılar Hoogsteen-bağlanma etkileşimleri yoluyla stabilize önemli ölçüde G4 yapıları 1, 2, termal stabilitesi katkı tek değerli katyonların (örneğin. K +, Na +) merkezi boşluk içinde bağlama koordinat. Erken biyoinformatik çalışmalar insan genomu> 375000 "potansiyel G4 oluşturan motifler" 3, 4 içerdiğini ileri sürdü. Daha yakın tarihli bir çalışma tahminleri başka bir çalışma insan genomunda 6 716.310 farklı potansiyel G4 oluşturan dizileri tahmin ederken G4 motifleri sayısı 2-5 5 faktör daha yüksek olduğunu göstermektedir. G4-şekillendirme dizileri evrimsel korunmuş ve rastgele dağılmış değilGenom. G4 motifleri gen kodlama bölgelerinde zenginleştirilmiş ve tüm gen promoteri% 40 yukarı doğru G4 motifleri 7 içerir. İlginç bir şekilde, bir gen G4 motifleri takviye derecesinin genin fonksiyonunu önermek gösterilmiştir. Örneğin, gelişiminde rol oynayan proto-onkogenler ve genler tümör baskılayıcı genlerin 8, 9 den G4 yapılarının önemli ölçüde daha fazla zenginleştirme var.
yüksek termal kararlılıkları sayesinde, genom boyunca neredeyse her yerde bulunması, ve önemli ölçüde büyük hücresel süreçleri etkileme potansiyeli, hücre bu yapıları yönetmek için enzimler gelişti bulmak için şaşırtıcı değildir. , Insan (HeLa) hücreleri 10 tetramolecular G4-DNA çözülmesi aktivitesi çoğunluğunun kaynağı olarak karakterize edilen Böyle bir enzim G4 Resolvase1 (ayrıca RHAU ve DHX36 adı G4R1) 'dir. O zamandan beri, bu gösterilmiştir that G4R1 biçimde bağlanır ve bir katalitik G4-bağlayıcı protein, 11, 12, 13 sıkı bildirilen Kd ile tetramolecular ve tek moleküllü G4 DNA ve G4 RNA unwinds. Buna ek olarak, G4R1 G4-çözme aktivitesi Telomer / telomeraz biyoloji 11, 14, 15, 16, transkripsiyon ve ekleme 17, 18, 19, 20, geliştirme 21 hematopoez içeren biyokimyasal ve hücresel süreçlerin, geniş bir yelpazede implike edilmiştir 21 ve bağışıklık düzenleme 22, 23. G4 dizilerinin bir üstünlüğü özellikle genom ve çeşitli hücresel p boyunca yer alan ileG4R1 geçenlerde ifade ve verimli bu proteinin biyokimyasal mekanizmaları ve davranışları ortaya çıkması için rG4R1 son derece önemli olacaktır son derece aktif arındırmak yeteneği ile ilgili olduğu karıştığı edildiğini rocesses.
Burada, yeni bir ifade ve verimli bir şekilde aktif enzim izole etmek rG4R1 ATP'ye bağımlı, G4-çözme aktivitesi yararlanır saflaştırma şeması (Şekil 1) göstermektedir. G4R1 olduğu gibi bu şema, enzimatik reaksiyonun ürünü artık bağlanması için bir substrat olan diğer ATP bağımlı nükleik asit enzimleri saflaştırmak için uyarlanabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, DHX36 gen ürününün, G4 Resolvase1 (ayrıca RHAU ve DHX36 adı G4R1) (Şekil 1) izole edilmesi için son derece etkili bir ekspresyonu, saflaştırılması, ve miktar şemasını temsil etmektedir. G4-DNA-konjuge boncuk His-tag afinite kobalt afinite boncuklar üzerinde arınma ve enzimatik saflaştırma: Bu protokol, iki arıtma adımları kullanır. İkinci adım, rG4R1 G4 yapılar için vardır sıkı afinite, yüksek özgüllük ve katalitik açma faaliyeti yararlanır olduğu benzer…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz (JPV için) Aktarma Vakfı cömert bir hediye de dahil olmak üzere, bizim finansman kaynaklarını teşekkür etmek istiyorum, (PJS için) (PJS kadar) HealthGrant T32-CA079448 ve Ball State University başlangıç fonları National Institutes of. fon çalışma dizaynı, veri toplama ve analizi, yayınlama kararı, ya da yazının hazırlanmasında hiçbir rolü vardı.
Materials
| TriEx4-DHX36 plasmid | Addgene | 68368 | |
| Rosetta2(DE3)plysS competent cells | Novagen | 71403-4 | |
| S.O.C medium | Thermo Fisher Scientific | 15544034 | |
| Difco Terrific Broth | Becton Dickinson | 243820 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C1919 | 35 µg/ml in bacterial plates/large cultures |
| Carbenicillin (plant cell culture tested) | Sigma-Aldrich | C3416 | 50 µg/ml in bacterial plates/large cultures |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| Lysozyme (from chicken egg white) | Sigma-Aldrich | L6876 | |
| 1 M Tris-HCl pH=8 | Universal Scientific Supply Co. | 1963-B | or From standard source |
| 1 M Tris-HCl pH=7 | Universal Scientific Supply Co. | 1966 | or From standard source |
| 1.5 M Tris-HCl, pH=8.8 | For casting resolving gel (for protein quantitation gel); From standard source | ||
| 1 M Tris-HCl, pH=6.8 | For casting stacking gel (for protein quantitation gel); From standard source | ||
| 1 M Tris-Acetate, pH=7.8 | Universal Scientific Supply Co. | 1981 | or From standard source |
| 70% Ethanol | From standard source | ||
| Magnesium chloride (1 M solution) | Life Technologies | AM9530G | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S8750 | |
| 20x SSC | Universal Scientific Supply Co. | 1665 | or From standard source |
| β-mercaptoethanol (2-BME) | Sigma-Aldrich | 63689 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8849 | |
| Leupeptin hemisulfate | Sigma-Aldrich | L8511 | |
| Streptavidin paramagnetic beads | Promega | Z5482 | |
| 0.5 M EDTA, pH=8 | Universal Scientific Supply Co. | 0718 | or From standard source |
| 0.2 M EDTA, pH=6 | Universal Scientific Supply Co. | From standard source; initially adjust pH with NaOH, then adjust pH back down with HCl. | |
| A-lactalbumin (Type 1 from bovine milk) | Sigma-Aldrich | L5385 | |
| Cobalt metal affinity beads | Clonetech | 635502 | |
| L-Histidine | Sigma-Aldrich | H8000 | |
| Acetic acid, glacial | Fisher Scientific | A38-500 | |
| Adenosine 5'-Triphosphate (from bacterial source) | Sigma | A7699 | |
| 40% acrylamide/Bis solution (37.5:1) | Biorad | 161-0148 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 50046 | to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS) |
| 10 % Sodium dodecyl sulfate | Universal Scientific Supply Co. | 1667 | to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS); or From standard source |
| 10x TBE | Sigma-Aldrich | 11666703001 | or From standard source |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS); From standard source |
| TEMED | Sigma-Aldrich | 411019 | |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| Broad Range Protein MW markers | Promega | V8491 | |
| Biotinylated Z33 oligo ("Z33-Bio") | Oligos Etc | 5’ AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT-biotin 3’ | |
| TAMRA-Z33 oligo ("Z33-TAM") | Oligos Etc | 5’ TAMRA-AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT 3’ | |
| Fluor-coated TLC plate | Life Technologies | AM10110 | |
| Ficoll | Sigma-Aldrich | F2637 | 30% in H2O |
| Coomassie R-250 | Sigma-Aldrich | 27816 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412 | |
| Multiband UV lamp | Capable of emitting UV light at 365 nm | ||
| Table-top centrifuge (with swinging bucket rotor) | Capable of being cooled to 4 °C | ||
| Microcentrifuge | Capable of being cooled to 4 °C | ||
| Digital Sonfier | Branson | Or equivalent capable of delivering sonication pulses (30% amplitude, 2s ON 2s OFF) | |
| 50 °C water bath | For formation of Z33 into quadruplex | ||
| 37 °C incubator for bacteria | For bacterial transformations and initial overnight growth of large cultures of Rosetta2 E. coli transformed with TriEx4-DHX36 | ||
| 37 °C/14 °C shaking incubator for bacteria | For growth and protein induction of large cultures of Rosetta2 E. coli transformed with TriEx4-DHX36 | ||
| Spectrophotometer | capable of reading OD600; capable of reading oligomer concentrations based on base sequence (such as Biorad SmartSpec 3000) | ||
| Thermometer | From standard source | ||
| PCR strip tubes | From standard source | ||
| 15- and 50-ml centrifuge tubes (polypropylene) | From standard source | ||
| Microcentrifuge tubes (2.0 ml) | From standard source | ||
| 500 ml centrifuge bottles (polypropylene) | Thermo Scientific | 3141-0500 | |
| Standard array of pipet tips and serological pipettes | From standard source | ||
| Gel-loading tips | From standard source | ||
| Automatic repeating pipette | For quick aliquoting of rG4R1; From standard source | ||
| Thermal cycler | From standard source | ||
| Liquid Nitrogen | From standard source | ||
| Dry ice | From standard source | ||
| Laemlli sample buffer | Biorad | 161-0737 | |
| Apparatus for running large slab gels | Biorad | We have used the Protean II xi cell apparatus from Biorad | |
| Magnet | Life Technologies | 12301D | We use a magnet from One Lambda (Now a Thermo Fisher Scientific brand); and Life is also a subsidiary of Thermo, and thus the magnet listed here should be a suitable replacement |
| Razor blades | From standard source | ||
| Filter paper and funnel | From standard source | ||
| Glass casserole dish | From standard source | ||
| Orbital shaker | From standard source | ||
| Kimwipes | From standard source | ||
| Clear sheet protectors | From standard source | ||
| Scanner and associated TWAIN software | From standard source | ||
| Image analysis software | Such as Fuji Multiguage, or equivalent | ||
| Microsoft Excel | Or equivalent |
Referencias
- Qin, Y., Hurley, L. H. Structures, folding patterns, and functions of intramolecular DNA G-quadruplexes found in eukaryotic promoter regions. Biochimie. 90 (8), 1149-1171 (2008).
- Stegle, O., Payet, L., Mergny, J. L., MacKay, D. J., Leon, J. H. Predicting and understanding the stability of G-quadruplexes. Bioinformatics. 25 (12), i374-i382 (2009).
- Todd, A. K., Johnston, M., Neidle, S. Highly prevalent putative quadruplex sequence motifs in human DNA. Nucleic Acids Res. 33 (9), 2901-2907 (2005).
- Huppert, J. L., Balasubramanian, S. Prevalence of quadruplexes in the human genome. Nucleic Acids Res. 33 (9), 2908-2916 (2005).
- Bedrat, A., Lacroix, L., Mergny, J. L. Re-evaluation of G-quadruplex propensity with G4Hunter. Nucleic Acids Res. 44 (4), 1746-1759 (2016).
- Mendoza, O., Bourdoncle, A., Boule, J. B., Brosh, R. M., Mergny, J. L. G-quadruplexes and helicases. Nucleic Acids Res. 44 (5), 1989-2006 (2016).
- Huppert, J. L., Balasubramanian, S. G-quadruplexes in promoters throughout the human genome. Nucleic Acids Res. 35 (2), 406-413 (2007).
- Eddy, J., Maizels, N. Gene function correlates with potential for G4 DNA formation in the human genome. Nucleic Acids Res. 34 (14), 3887-3896 (2006).
- Eddy, J., et al. G4 motifs correlate with promoter-proximal transcriptional pausing in human genes. Nucleic Acids Res. 39 (12), 4975-4983 (2011).
- Vaughn, J. P., et al. The DEXH protein product of the DHX36 gene is the major source of tetramolecular quadruplex G4-DNA resolving activity in HeLa cell lysates. J Biol Chem. 280 (46), 38117-38120 (2005).
- Booy, E. P., et al. The RNA helicase RHAU (DHX36) unwinds a G4-quadruplex in human telomerase RNA and promotes the formation of the P1 helix template boundary. Nucleic Acids Res. 40 (9), 4110-4124 (2012).
- Creacy, S. D., et al. G4 resolvase 1 binds both DNA and RNA tetramolecular quadruplex with high affinity and is the major source of tetramolecular quadruplex G4-DNA and G4-RNA resolving activity in HeLa cell lysates. J Biol Chem. 283 (50), 34626-34634 (2008).
- Giri, B., et al. G4 resolvase 1 tightly binds and unwinds unimolecular G4-DNA. Nucleic Acids Res. 39 (16), 7161-7178 (2011).
- Lattmann, S., Stadler, M. B., Vaughn, J. P., Akman, S. A., Nagamine, Y. The DEAH-box RNA helicase RHAU binds an intramolecular RNA G-quadruplex in TERC and associates with telomerase holoenzyme. Nucleic Acids Res. 39 (21), 9390-9404 (2011).
- Sexton, A. N., Collins, K. The 5′ guanosine tracts of human telomerase RNA are recognized by the G-quadruplex binding domain of the RNA helicase DHX36 and function to increase RNA accumulation. Mol Cell Biol. 31 (4), 736-743 (2011).
- Smaldino, P. J., et al. Mutational Dissection of Telomeric DNA Binding Requirements of G4 Resolvase 1 Shows that G4-Structure and Certain 3′-Tail Sequences Are Sufficient for Tight and Complete Binding. PLoS One. 10 (7), e0132668 (2015).
- Booy, E. P., et al. The RNA helicase RHAU (DHX36) suppresses expression of the transcription factor PITX1. Nucleic Acids Res. 42 (5), 3346-3361 (2014).
- Huang, W., et al. Yin Yang 1 contains G-quadruplex structures in its promoter and 5′-UTR and its expression is modulated by G4 resolvase 1. Nucleic Acids Res. 40 (3), 1033-1049 (2012).
- Tran, H., Schilling, M., Wirbelauer, C., Hess, D., Nagamine, Y. Facilitation of mRNA deadenylation and decay by the exosome-bound, DExH protein RHAU. Mol Cell. 13 (1), 101-111 (2004).
- Yoo, J. S., et al. DHX36 enhances RIG-I signaling by facilitating PKR-mediated antiviral stress granule formation. PLoS Pathog. 10 (3), e1004012 (2014).
- Lai, J. C., et al. The DEAH-box helicase RHAU is an essential gene and critical for mouse hematopoiesis. Blood. 119 (18), 4291-4300 (2012).
- Zhang, Z., et al. DDX1, DDX21, and DHX36 helicases form a complex with the adaptor molecule TRIF to sense dsRNA in dendritic cells. Immunity. 34 (6), 866-878 (2011).
- Kim, T., et al. Aspartate-glutamate-alanine-histidine box motif (DEAH)/RNA helicase A helicases sense microbial DNA in human plasmacytoid dendritic cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (34), 15181-15186 (2010).
- Booy, E. P., McRae, E. K., McKenna, S. A. Biochemical characterization of G4 quadruplex telomerase RNA unwinding by the RNA helicase RHAU. Methods Mol Biol. 1259, 125-135 (2015).
- Lattmann, S., Giri, B., Vaughn, J. P., Akman, S. A., Nagamine, Y. Role of the amino terminal RHAU-specific motif in the recognition and resolution of guanine quadruplex-RNA by the DEAH-box RNA helicase RHAU. Nucleic Acids Res. 38 (18), 6219-6233 (2010).
