G-квадруплекс ДНК-сродства подход для очистки ферментативно активной G4 Resolvase1
Summary
G4 Resolvase1 связывается с G-квадруплексных (G4) структур с тайтового сообщенной сродства к G4-связывающего белка и представляет большинство разматывания активности G4-ДНК в клетках HeLa. Мы опишем протокол романа, использующую сродство и АТФ-зависимый разматывания активность G4-Resolvase1 специфически очистить каталитически активный рекомбинантный G4R1.
Abstract
структуры высшего порядка нуклеиновых кислот под названием G-квадруплексы (G4S, G4 структуры) могут образовываться в гуанин богатых регионах ДНК и РНК и высокой термостойкостью. Есть> 375000 предположительные G4 формирования последовательностей в геноме человека, и они обогащены промоторной области, нетранслируемые области (НТО), и в пределах теломерном повтора. Из-за возможности эти структуры, чтобы влиять на клеточные процессы, такие как репликации и транскрипции, клетка эволюционировала ферменты, чтобы управлять ими. Одним из таких ферментов является G4 Resolvase 1 (G4R1), который биохимически совместно характеризуется нашей лаборатории и Нагамине и др. и нашел чрезвычайно плотно и к G4-ДНК и РНК-G4 (K D в диапазоне низких фазовую) связываться. G4R1 является источником большинства G4-разрешения активности в лизатах HeLa клеток и с тех пор было вовлечено играть определенную роль в теломер метаболизма, развитие лимфатического, транскрипции генов, кроветворения и иммунного надзора. Возможность Е.Ф.статочно экспрессировать и очистить каталитически активным G4R1 имеет важное значение для лабораторий, заинтересованных в получении дальнейшее понимание кинетического взаимодействия G4 структур и G4-решения ферментов. Здесь мы опишем подробный способ очистки рекомбинантного G4R1 (rG4R1). Описанная процедура включает традиционные аффинной очистки на основе из С-концевого гистидина-меченый фермент, экспрессированный в человеческих оптимизированной в отношении кодонов бактерий с использованием способности rG4R1 связывать и разматывать G4-ДНК для очистки высоко активного фермента в АТФ зависимой стадию элюирования. Протокол также включает в себя этап контроля качества, где ферментативная активность rG4R1 измеряется путем изучения способности очищенного фермента раскрутиться G4-ДНК. Способ также описывается, что позволяет для количественного определения очищенного rG4R1. Альтернативные приспособления этого протокола обсуждаются.
Introduction
G4 структуры обладают высокой стабильностью нуклеиновых кислот, вторичные структуры, которые формируются в пределах гуанин богатых участков ДНК и РНК. G4 структуры стабилизируются с помощью Хугстена-связывающих взаимодействий и координировать соединение в пределах центральной полости с одновалентных катионов (например. K + и Na +) , которые вносят значительный вклад в замечательный термостойкости G4 конструкций 1, 2. Ранние биоинформатики исследования позволяют предположить , что геном человека содержит> 375000 "потенциальные G4 образующие мотивы" 3, 4. Другие оценки недавние исследования позволяют предположить , что число G4 мотивов раза выше 2-5 5, в то время как другое исследование предсказывает 716,310 различные потенциальные последовательности G4 формирования в геноме человека 6. G4-формовка последовательности эволюционно консервативны и не рассредоточено вгеном. G4 мотивы обогащены генов , кодирующих областей, и свыше 40% всех промоторов генов содержат G4 мотивы 7. Интересно отметить, что степень обогащения G4 мотивов в гене было продемонстрировано, чтобы предложить функцию гена. Например, прото-онкогенов и генов , участвующих в развитии , имеют значительно большее обогащение G4 структур , чем генов – супрессоров 8, 9.
С высокой термостабильности, почти повсеместное присутствие по всему геному, и потенциал, чтобы существенно повлиять на основные клеточные процессы, то неудивительно, чтобы обнаружить, что клетка эволюционировала ферменты для управления этими структурами. Одним из таких ферментов является G4 Resolvase1 (G4R1, называемый также RHAU и DHX36), которое мы охарактеризовали как источник большинства tetramolecular G4-ДНК – разрешающего активности в человека (HeLa) клеток 10. С тех пор было показано, тхат G4R1 прочно связывается и каталитически раскручивается tetramolecular и мономолекулярному G4-ДНК и РНК-G4 с стесненных сообщившим KDS для G4-связывающего белка 11, 12, 13. Кроме того, G4-разрешения активность G4R1 участвует в широком диапазоне биохимических и клеточных процессов, в том числе теломер / теломеразы биологии 11, 14, 15, 16, транскрипции и сплайсинга 17, 18, 19, 20, развитие 21, кроветворение 21 и регуляции иммунной системы 22, 23. С перевес G4 последовательностей специфически расположенной по всему геному и разнообразной клеточной рrocesses, что G4R1 недавно был замешан быть связан с, способностью выражать и эффективно очищать высокоактивной rG4R1 будет иметь огромное значение для выяснения биохимических механизмов и поведения этого белка.
Здесь мы покажем новую схему экспрессии и очистки (Рисунок 1) , который использует АТФ-зависимый, G4-разрешения деятельности rG4R1 эффективно изолировать активный фермент. Эта схема может быть приспособлена для очистки других АТФ-зависимых ферментов нуклеиновых кислот, для которых продукт ферментативной реакции больше не является субстратом для связывания, как это имеет место для G4R1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол представляет собой высокоэффективную экспрессии, очистки и схему количественного определения для выделения продукта гена DHX36, G4-Resolvase1 (G4R1, называемый также RHAU и DHX36) (рисунок 1). Этот протокол использует две стадии очистки: His-Tag аффинной очистки на кобальтовых срод…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить наших источников финансирования, в том числе щедрый подарок от Ware Foundation (до JPV), Национальные институты HealthGrant T32-CA079448 (к PJS), а также средства запуска Ball State University (к PJS). Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи.
Materials
| TriEx4-DHX36 plasmid | Addgene | 68368 | |
| Rosetta2(DE3)plysS competent cells | Novagen | 71403-4 | |
| S.O.C medium | Thermo Fisher Scientific | 15544034 | |
| Difco Terrific Broth | Becton Dickinson | 243820 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C1919 | 35 µg/ml in bacterial plates/large cultures |
| Carbenicillin (plant cell culture tested) | Sigma-Aldrich | C3416 | 50 µg/ml in bacterial plates/large cultures |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| Lysozyme (from chicken egg white) | Sigma-Aldrich | L6876 | |
| 1 M Tris-HCl pH=8 | Universal Scientific Supply Co. | 1963-B | or From standard source |
| 1 M Tris-HCl pH=7 | Universal Scientific Supply Co. | 1966 | or From standard source |
| 1.5 M Tris-HCl, pH=8.8 | For casting resolving gel (for protein quantitation gel); From standard source | ||
| 1 M Tris-HCl, pH=6.8 | For casting stacking gel (for protein quantitation gel); From standard source | ||
| 1 M Tris-Acetate, pH=7.8 | Universal Scientific Supply Co. | 1981 | or From standard source |
| 70% Ethanol | From standard source | ||
| Magnesium chloride (1 M solution) | Life Technologies | AM9530G | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S8750 | |
| 20x SSC | Universal Scientific Supply Co. | 1665 | or From standard source |
| β-mercaptoethanol (2-BME) | Sigma-Aldrich | 63689 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8849 | |
| Leupeptin hemisulfate | Sigma-Aldrich | L8511 | |
| Streptavidin paramagnetic beads | Promega | Z5482 | |
| 0.5 M EDTA, pH=8 | Universal Scientific Supply Co. | 0718 | or From standard source |
| 0.2 M EDTA, pH=6 | Universal Scientific Supply Co. | From standard source; initially adjust pH with NaOH, then adjust pH back down with HCl. | |
| A-lactalbumin (Type 1 from bovine milk) | Sigma-Aldrich | L5385 | |
| Cobalt metal affinity beads | Clonetech | 635502 | |
| L-Histidine | Sigma-Aldrich | H8000 | |
| Acetic acid, glacial | Fisher Scientific | A38-500 | |
| Adenosine 5'-Triphosphate (from bacterial source) | Sigma | A7699 | |
| 40% acrylamide/Bis solution (37.5:1) | Biorad | 161-0148 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 50046 | to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS) |
| 10 % Sodium dodecyl sulfate | Universal Scientific Supply Co. | 1667 | to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS); or From standard source |
| 10x TBE | Sigma-Aldrich | 11666703001 | or From standard source |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS); From standard source |
| TEMED | Sigma-Aldrich | 411019 | |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| Broad Range Protein MW markers | Promega | V8491 | |
| Biotinylated Z33 oligo ("Z33-Bio") | Oligos Etc | 5’ AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT-biotin 3’ | |
| TAMRA-Z33 oligo ("Z33-TAM") | Oligos Etc | 5’ TAMRA-AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT 3’ | |
| Fluor-coated TLC plate | Life Technologies | AM10110 | |
| Ficoll | Sigma-Aldrich | F2637 | 30% in H2O |
| Coomassie R-250 | Sigma-Aldrich | 27816 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412 | |
| Multiband UV lamp | Capable of emitting UV light at 365 nm | ||
| Table-top centrifuge (with swinging bucket rotor) | Capable of being cooled to 4 °C | ||
| Microcentrifuge | Capable of being cooled to 4 °C | ||
| Digital Sonfier | Branson | Or equivalent capable of delivering sonication pulses (30% amplitude, 2s ON 2s OFF) | |
| 50 °C water bath | For formation of Z33 into quadruplex | ||
| 37 °C incubator for bacteria | For bacterial transformations and initial overnight growth of large cultures of Rosetta2 E. coli transformed with TriEx4-DHX36 | ||
| 37 °C/14 °C shaking incubator for bacteria | For growth and protein induction of large cultures of Rosetta2 E. coli transformed with TriEx4-DHX36 | ||
| Spectrophotometer | capable of reading OD600; capable of reading oligomer concentrations based on base sequence (such as Biorad SmartSpec 3000) | ||
| Thermometer | From standard source | ||
| PCR strip tubes | From standard source | ||
| 15- and 50-ml centrifuge tubes (polypropylene) | From standard source | ||
| Microcentrifuge tubes (2.0 ml) | From standard source | ||
| 500 ml centrifuge bottles (polypropylene) | Thermo Scientific | 3141-0500 | |
| Standard array of pipet tips and serological pipettes | From standard source | ||
| Gel-loading tips | From standard source | ||
| Automatic repeating pipette | For quick aliquoting of rG4R1; From standard source | ||
| Thermal cycler | From standard source | ||
| Liquid Nitrogen | From standard source | ||
| Dry ice | From standard source | ||
| Laemlli sample buffer | Biorad | 161-0737 | |
| Apparatus for running large slab gels | Biorad | We have used the Protean II xi cell apparatus from Biorad | |
| Magnet | Life Technologies | 12301D | We use a magnet from One Lambda (Now a Thermo Fisher Scientific brand); and Life is also a subsidiary of Thermo, and thus the magnet listed here should be a suitable replacement |
| Razor blades | From standard source | ||
| Filter paper and funnel | From standard source | ||
| Glass casserole dish | From standard source | ||
| Orbital shaker | From standard source | ||
| Kimwipes | From standard source | ||
| Clear sheet protectors | From standard source | ||
| Scanner and associated TWAIN software | From standard source | ||
| Image analysis software | Such as Fuji Multiguage, or equivalent | ||
| Microsoft Excel | Or equivalent |
Referencias
- Qin, Y., Hurley, L. H. Structures, folding patterns, and functions of intramolecular DNA G-quadruplexes found in eukaryotic promoter regions. Biochimie. 90 (8), 1149-1171 (2008).
- Stegle, O., Payet, L., Mergny, J. L., MacKay, D. J., Leon, J. H. Predicting and understanding the stability of G-quadruplexes. Bioinformatics. 25 (12), i374-i382 (2009).
- Todd, A. K., Johnston, M., Neidle, S. Highly prevalent putative quadruplex sequence motifs in human DNA. Nucleic Acids Res. 33 (9), 2901-2907 (2005).
- Huppert, J. L., Balasubramanian, S. Prevalence of quadruplexes in the human genome. Nucleic Acids Res. 33 (9), 2908-2916 (2005).
- Bedrat, A., Lacroix, L., Mergny, J. L. Re-evaluation of G-quadruplex propensity with G4Hunter. Nucleic Acids Res. 44 (4), 1746-1759 (2016).
- Mendoza, O., Bourdoncle, A., Boule, J. B., Brosh, R. M., Mergny, J. L. G-quadruplexes and helicases. Nucleic Acids Res. 44 (5), 1989-2006 (2016).
- Huppert, J. L., Balasubramanian, S. G-quadruplexes in promoters throughout the human genome. Nucleic Acids Res. 35 (2), 406-413 (2007).
- Eddy, J., Maizels, N. Gene function correlates with potential for G4 DNA formation in the human genome. Nucleic Acids Res. 34 (14), 3887-3896 (2006).
- Eddy, J., et al. G4 motifs correlate with promoter-proximal transcriptional pausing in human genes. Nucleic Acids Res. 39 (12), 4975-4983 (2011).
- Vaughn, J. P., et al. The DEXH protein product of the DHX36 gene is the major source of tetramolecular quadruplex G4-DNA resolving activity in HeLa cell lysates. J Biol Chem. 280 (46), 38117-38120 (2005).
- Booy, E. P., et al. The RNA helicase RHAU (DHX36) unwinds a G4-quadruplex in human telomerase RNA and promotes the formation of the P1 helix template boundary. Nucleic Acids Res. 40 (9), 4110-4124 (2012).
- Creacy, S. D., et al. G4 resolvase 1 binds both DNA and RNA tetramolecular quadruplex with high affinity and is the major source of tetramolecular quadruplex G4-DNA and G4-RNA resolving activity in HeLa cell lysates. J Biol Chem. 283 (50), 34626-34634 (2008).
- Giri, B., et al. G4 resolvase 1 tightly binds and unwinds unimolecular G4-DNA. Nucleic Acids Res. 39 (16), 7161-7178 (2011).
- Lattmann, S., Stadler, M. B., Vaughn, J. P., Akman, S. A., Nagamine, Y. The DEAH-box RNA helicase RHAU binds an intramolecular RNA G-quadruplex in TERC and associates with telomerase holoenzyme. Nucleic Acids Res. 39 (21), 9390-9404 (2011).
- Sexton, A. N., Collins, K. The 5′ guanosine tracts of human telomerase RNA are recognized by the G-quadruplex binding domain of the RNA helicase DHX36 and function to increase RNA accumulation. Mol Cell Biol. 31 (4), 736-743 (2011).
- Smaldino, P. J., et al. Mutational Dissection of Telomeric DNA Binding Requirements of G4 Resolvase 1 Shows that G4-Structure and Certain 3′-Tail Sequences Are Sufficient for Tight and Complete Binding. PLoS One. 10 (7), e0132668 (2015).
- Booy, E. P., et al. The RNA helicase RHAU (DHX36) suppresses expression of the transcription factor PITX1. Nucleic Acids Res. 42 (5), 3346-3361 (2014).
- Huang, W., et al. Yin Yang 1 contains G-quadruplex structures in its promoter and 5′-UTR and its expression is modulated by G4 resolvase 1. Nucleic Acids Res. 40 (3), 1033-1049 (2012).
- Tran, H., Schilling, M., Wirbelauer, C., Hess, D., Nagamine, Y. Facilitation of mRNA deadenylation and decay by the exosome-bound, DExH protein RHAU. Mol Cell. 13 (1), 101-111 (2004).
- Yoo, J. S., et al. DHX36 enhances RIG-I signaling by facilitating PKR-mediated antiviral stress granule formation. PLoS Pathog. 10 (3), e1004012 (2014).
- Lai, J. C., et al. The DEAH-box helicase RHAU is an essential gene and critical for mouse hematopoiesis. Blood. 119 (18), 4291-4300 (2012).
- Zhang, Z., et al. DDX1, DDX21, and DHX36 helicases form a complex with the adaptor molecule TRIF to sense dsRNA in dendritic cells. Immunity. 34 (6), 866-878 (2011).
- Kim, T., et al. Aspartate-glutamate-alanine-histidine box motif (DEAH)/RNA helicase A helicases sense microbial DNA in human plasmacytoid dendritic cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (34), 15181-15186 (2010).
- Booy, E. P., McRae, E. K., McKenna, S. A. Biochemical characterization of G4 quadruplex telomerase RNA unwinding by the RNA helicase RHAU. Methods Mol Biol. 1259, 125-135 (2015).
- Lattmann, S., Giri, B., Vaughn, J. P., Akman, S. A., Nagamine, Y. Role of the amino terminal RHAU-specific motif in the recognition and resolution of guanine quadruplex-RNA by the DEAH-box RNA helicase RHAU. Nucleic Acids Res. 38 (18), 6219-6233 (2010).
