Une approche du G-quadruplex ADN-affinité pour la purification de l'activité enzymatique G4 Resolvase1
Summary
G4 Resolvase1 se lie à G-quadruplex (G4) structures avec le plus serré affinité rapportée pour une protéine G4 contraignante et représente la majorité de l'activité de déroulage G4-ADN dans les cellules HeLa. Nous décrivons un nouveau protocole qui tire parti de l'affinité et de l'activité ATP-dépendante dévidage de G4-Resolvase1 pour purifier spécifiquement G4R1 recombinante catalytiquement active.
Abstract
Ordre supérieur des structures d'acides nucléiques appelés G-quadruplex (G4s, structures G4) peuvent se former dans les régions riches en guanine de l'ADN et l'ARN et sont très stables thermiquement. Il y a> 375.000 putatifs séquences G4 formation dans le génome humain, et ils sont enrichis dans les régions de promoteurs, régions non traduites (UTR), et dans la répétition télomérique. En raison du potentiel de ces structures affectent les processus cellulaires tels que la réplication et la transcription, la cellule a évolué enzymes pour les gérer. Une telle enzyme est une résolvase G4 (G4R1), qui a été co-biochimiquement caractérisée par notre laboratoire et Nagamine et al. et a trouvé à se lier très étroitement à la fois G4-ADN et G4-ARN (K d dans la gamme basse pM). G4R1 est la source de la majeure partie de l'activité de G4 à résolution dans les lysats cellulaires HeLa et a depuis été impliquée pour jouer un rôle dans le métabolisme du télomère, le développement de la lymphe, la transcription des gènes, de l'hématopoïèse et de la surveillance immunitaire. La capacité d'efsamment exprimer et purifier catalytiquement active G4R1 est d'une importance pour les laboratoires intéressés à acquérir un éclairage supplémentaire sur l'interaction cinétique des structures G4 et enzymes G4-résoudre. Ici, nous décrivons une méthode détaillée pour la purification de recombinant G4R1 (rG4R1). Le mode opératoire décrit comprend la traditionnelle purification par affinité d'une histidine enzyme C-terminale exprimée dans des bactéries de codon optimisé pour l'homme avec l'utilisation de la capacité de rG4R1 à se lier et se détendre G4-ADN pour purifier une enzyme hautement actif dans une ATP- étape d'élution dépendante. Le protocole comprend en outre une étape de contrôle de qualité, où l'activité enzymatique de rG4R1 est mesurée en examinant la capacité de l'enzyme purifiée pour dérouler l'ADN-G4. Un procédé est également décrit qui permet la quantification de rG4R1 purifié. adaptations alternatives de ce protocole sont discutées.
Introduction
structures G4 sont des structures secondaires d'acides nucléiques très stables qui se forment dans les régions riches en guanine de l'ADN et de l'ARN. Structures G4 sont stabilisées par des interactions Hoogsteen-liaison et coordonner la liaison au sein de la cavité centrale avec des cations monovalents (ie. K + et Na +) qui contribuent de manière significative à la stabilité thermique remarquable des structures G4 1, 2. Des études précoces de bioinformatique ont suggéré que le génome humain contient> 375.000 "motifs G4 formation potentiels" 3, 4. Les estimations des études plus récentes indiquent que le nombre de motifs G4 est plus élevé par un facteur de 2 à 5 mai, tandis qu'une autre étude prévoit 716,310 séquences G4 formant potentiels distincts dans le génome humain 6. G4-formation de séquences sont évolutivement conservée et non dispersé de façon aléatoire dansle génome. Motifs G4 sont enrichis dans les régions codantes de gènes, et vers le haut de 40% de tous les promoteurs de gènes contiennent G4 motifs 7. Chose intéressante, le degré d'enrichissement des motifs G4 dans un gène a été démontrée pour suggérer la fonction du gène. Par exemple, les proto-oncogènes et les gènes impliqués dans le développement ont significativement plus enrichissement des structures G4 que les gènes suppresseurs de tumeur 8, 9.
Avec stabilités thermiques élevées, une présence presque omniprésente dans tout le génome, et le potentiel d'affecter de manière significative les principaux processus cellulaires, il est surprenant de constater que la cellule a évolué enzymes pour gérer ces structures. Une telle enzyme est G4 Resolvase1 (G4R1; également appelé Rhau et DHX36), que nous caractérisons comme la source de la majorité des activités de résoudre G4-ADN tétramoléculaire dans (HeLa) des cellules humaines 10. Depuis lors, il a été montré that G4R1 étroitement lie et catalytiquement G4-ADN déroule tétramoléculaire et unimoléculaire et G4-ARN avec les plus serrés KD rapportés pour une protéine G4 de liaison 11, 12, 13. En outre, l'activité de G4-résolution des G4R1 a été impliquée dans un large éventail de processus biochimiques et cellulaires, y compris télomère / télomérase biologie 11, 14, 15, 16, de la transcription et de l' épissage 17, 18, 19, 20, le développement 21, de l' hématopoïèse 21 et immunitaire régulation 22, 23. Avec une prépondérance de séquences G4 spécifiquement situé dans le génome et la diversité cellulaire processus que G4R1 a récemment été impliqué d'être impliqué, la capacité d'exprimer et efficacement purifier très actif rG4R1 sera de la plus haute importance pour élucider les mécanismes biochimiques et les comportements de cette protéine.
Ici, nous démontrons une expression nouvelle et système de purification (Figure 1) qui tire profit de l'activité dépendant de l' ATP G4-résolution des rG4R1 pour isoler efficacement enzyme active. Ce système pourrait être adapté pour purifier d'autres enzymes d'acide nucléique dépendant de l'ATP pour lequel le produit de la réaction enzymatique est plus un substrat pour la liaison, comme cela est le cas pour G4R1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole représente une expression, la purification et la quantification schéma très efficace pour l'isolement du produit génique DHX36, G4 Resolvase1 (G4R1, appelé aussi Rhau et DHX36) (figure 1). Ce protocole utilise deux étapes de purification: His-tag purification par affinité sur des billes d'affinité de cobalt et de purification enzymatique sur des billes G4-ADN conjugué. Cette dernière étape est unique en ce qu'il tire parti de l'affinité serré, une spécificité …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier nos sources de financement, y compris un don généreux de la Fondation Ware (à JPV), Les National Institutes of HealthGrant T32-CA079448 (à PJS), et les fonds de démarrage de l'Université Ball State (à PJS). Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit.
Materials
| TriEx4-DHX36 plasmid | Addgene | 68368 | |
| Rosetta2(DE3)plysS competent cells | Novagen | 71403-4 | |
| S.O.C medium | Thermo Fisher Scientific | 15544034 | |
| Difco Terrific Broth | Becton Dickinson | 243820 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C1919 | 35 µg/ml in bacterial plates/large cultures |
| Carbenicillin (plant cell culture tested) | Sigma-Aldrich | C3416 | 50 µg/ml in bacterial plates/large cultures |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| Lysozyme (from chicken egg white) | Sigma-Aldrich | L6876 | |
| 1 M Tris-HCl pH=8 | Universal Scientific Supply Co. | 1963-B | or From standard source |
| 1 M Tris-HCl pH=7 | Universal Scientific Supply Co. | 1966 | or From standard source |
| 1.5 M Tris-HCl, pH=8.8 | For casting resolving gel (for protein quantitation gel); From standard source | ||
| 1 M Tris-HCl, pH=6.8 | For casting stacking gel (for protein quantitation gel); From standard source | ||
| 1 M Tris-Acetate, pH=7.8 | Universal Scientific Supply Co. | 1981 | or From standard source |
| 70% Ethanol | From standard source | ||
| Magnesium chloride (1 M solution) | Life Technologies | AM9530G | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S8750 | |
| 20x SSC | Universal Scientific Supply Co. | 1665 | or From standard source |
| β-mercaptoethanol (2-BME) | Sigma-Aldrich | 63689 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8849 | |
| Leupeptin hemisulfate | Sigma-Aldrich | L8511 | |
| Streptavidin paramagnetic beads | Promega | Z5482 | |
| 0.5 M EDTA, pH=8 | Universal Scientific Supply Co. | 0718 | or From standard source |
| 0.2 M EDTA, pH=6 | Universal Scientific Supply Co. | From standard source; initially adjust pH with NaOH, then adjust pH back down with HCl. | |
| A-lactalbumin (Type 1 from bovine milk) | Sigma-Aldrich | L5385 | |
| Cobalt metal affinity beads | Clonetech | 635502 | |
| L-Histidine | Sigma-Aldrich | H8000 | |
| Acetic acid, glacial | Fisher Scientific | A38-500 | |
| Adenosine 5'-Triphosphate (from bacterial source) | Sigma | A7699 | |
| 40% acrylamide/Bis solution (37.5:1) | Biorad | 161-0148 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 50046 | to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS) |
| 10 % Sodium dodecyl sulfate | Universal Scientific Supply Co. | 1667 | to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS); or From standard source |
| 10x TBE | Sigma-Aldrich | 11666703001 | or From standard source |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS); From standard source |
| TEMED | Sigma-Aldrich | 411019 | |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| Broad Range Protein MW markers | Promega | V8491 | |
| Biotinylated Z33 oligo ("Z33-Bio") | Oligos Etc | 5’ AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT-biotin 3’ | |
| TAMRA-Z33 oligo ("Z33-TAM") | Oligos Etc | 5’ TAMRA-AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT 3’ | |
| Fluor-coated TLC plate | Life Technologies | AM10110 | |
| Ficoll | Sigma-Aldrich | F2637 | 30% in H2O |
| Coomassie R-250 | Sigma-Aldrich | 27816 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412 | |
| Multiband UV lamp | Capable of emitting UV light at 365 nm | ||
| Table-top centrifuge (with swinging bucket rotor) | Capable of being cooled to 4 °C | ||
| Microcentrifuge | Capable of being cooled to 4 °C | ||
| Digital Sonfier | Branson | Or equivalent capable of delivering sonication pulses (30% amplitude, 2s ON 2s OFF) | |
| 50 °C water bath | For formation of Z33 into quadruplex | ||
| 37 °C incubator for bacteria | For bacterial transformations and initial overnight growth of large cultures of Rosetta2 E. coli transformed with TriEx4-DHX36 | ||
| 37 °C/14 °C shaking incubator for bacteria | For growth and protein induction of large cultures of Rosetta2 E. coli transformed with TriEx4-DHX36 | ||
| Spectrophotometer | capable of reading OD600; capable of reading oligomer concentrations based on base sequence (such as Biorad SmartSpec 3000) | ||
| Thermometer | From standard source | ||
| PCR strip tubes | From standard source | ||
| 15- and 50-ml centrifuge tubes (polypropylene) | From standard source | ||
| Microcentrifuge tubes (2.0 ml) | From standard source | ||
| 500 ml centrifuge bottles (polypropylene) | Thermo Scientific | 3141-0500 | |
| Standard array of pipet tips and serological pipettes | From standard source | ||
| Gel-loading tips | From standard source | ||
| Automatic repeating pipette | For quick aliquoting of rG4R1; From standard source | ||
| Thermal cycler | From standard source | ||
| Liquid Nitrogen | From standard source | ||
| Dry ice | From standard source | ||
| Laemlli sample buffer | Biorad | 161-0737 | |
| Apparatus for running large slab gels | Biorad | We have used the Protean II xi cell apparatus from Biorad | |
| Magnet | Life Technologies | 12301D | We use a magnet from One Lambda (Now a Thermo Fisher Scientific brand); and Life is also a subsidiary of Thermo, and thus the magnet listed here should be a suitable replacement |
| Razor blades | From standard source | ||
| Filter paper and funnel | From standard source | ||
| Glass casserole dish | From standard source | ||
| Orbital shaker | From standard source | ||
| Kimwipes | From standard source | ||
| Clear sheet protectors | From standard source | ||
| Scanner and associated TWAIN software | From standard source | ||
| Image analysis software | Such as Fuji Multiguage, or equivalent | ||
| Microsoft Excel | Or equivalent |
Referencias
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