Imagerie in vivo de Transgenic Gene Expression en Retinal individuelle progéniteurs dans chimériques Zebrafish Embryons à étudier cellulaires Influences non autonomes

La capacité à visualiser les processus de développement importants dans un vertébré in vivo a contribué à faire du zebrafish un modèle clé pour l' étude des conditions normales et pathologiques (revue en ^{1, 2).} En particulier, la rétine neurale est une partie accessible du système nerveux central. La rétine se prête à exécuter aisément des études de la neurogenèse en raison de sa très organisée, mais la structure relativement simple, et les types de neurones hautement conservées entre les espèces de vertébrés ^3. Dynamique des comportements cellulaires tels que la prolifération, la sortie du cycle cellulaire, la division cellulaire asymétrique, la spécification du destin, la différenciation et la formation des circuits neuronaux peuvent être suivis tout au long de l'ensemble du processus de rétinogenèse, qui est complétée dans la rétine centrale du poisson zèbre par 3 d post-fécondation ( dpf) ^{4, 5,}ref "> ^{6, 7.}

En outre, les exigences fonctionnelles des différents gènes dans chacune des étapes mentionnées ci-dessus peuvent être concomitantly évalués dans la rétine de poisson zèbre, fournissant un avantage sur les autres modèles vertébrés dans lequel phénotypes résultant de l'application des techniques de knock-out du gène ne peut être évaluée lors de l'examen post-mortem des tissus fixe. En particulier, l'utilisation de lignées transgéniques dans lesquelles nous pouvons visualiser et de contrôler l'expression de protéines fluorescentes comme transgènes rapporteurs dans la rétine, nous permet d'obtenir une résolution temporelle de l'expression des gènes qui sous-tend la genèse d'un type neuronal particulier de cellules. En raison du développement rapide de poisson-zèbre, ces événements peuvent être visualisés au cours de toute la période du développement, fournissant ainsi une connaissance plus approfondie de l'importance temporelle de l'expression des gènes en relation avec l'acquisition de l'identité de la cellule neuronale et le comportement des cellules.

Enfin, ces approches peuvent être combinées de manière efficace dans le poisson zèbre avec la génération d'une chimère via la transplantation, ce qui entraîne un aperçu de deux aspects clés de la fonction des gènes. Tout d'abord, en examinant les cellules transplantées à partir d'un embryon de donneur, dans laquelle un gène particulier a été renversé alors qu'ils se développent dans un environnement non marqué de type sauvage, nous permet d'obtenir des informations pertinentes sur la fonction des gènes d'une manière cellulaire autonome. Cela conduit à des informations importantes sur la fonction de la rétine facteurs sort déterminants au sein des cellules progénitrices ils sont normalement exprimés. Ceci est illustré par l'examen du sort des résultats de développement des progéniteurs qui ne peuvent plus générer une protéine fonctionnelle de ces gènes ^{4, 6, 8, 9.} En utilisant cette approche, nous avons montré que les facteurs déterminants du devenir beaucoup (par exemple, Vsx1, Atoh7, Ptf1a, Barhl2) agissent cellule-autonomously à conduire destins neuronales rétiniennes spécifiques; l'absence d'expression du gène conduit principalement à un commutateur sort, de telle sorte que les cellules avec le gène knockdown restent viables en adoptant un sort de remplacement cellulaire ^{4, 6, 7, 10.} Deuxièmement, ces expériences chimériques peuvent être utilisés pour évaluer la façon dont sauvage progéniteurs de type se comportent quand ils se développent dans différents environnements génétiques. Par exemple, en comparant le développement des cellules WT qui expriment habituellement un gène d'intérêt (et journaliste transgène) dans un WT contre environnement hôte manipulé (par exemple, KO génique / knockdown), les effets induits sur l' expression génique et le destin des cellules peuvent être évaluées . L'absence de certains types de neurones dans l'environnement hôte, par exemple, a été montré, pour influencer le comportement progénitrices de type sauvage d'une manière non-autonome cellulaire, pour solliciter eux vers la différenciation dans l'o sous-représentéesr manquant types de neurones ^{4, 7, 11, 12.} Étant donné que les neurones de la rétine sont nés dans un ordre histogène conservé par l'expression séquentiellement chronométré de gènes spécifiques sort déterminants neuronales (expression du gène sort) (revue dans ^13), nous avons utilisé ces méthodes pour démontrer comment le moment de l' expression du gène sort dans les progéniteurs de type sauvage est affectée lorsque ces progéniteurs se développent dans des environnements d'accueil rétiniens avec des compositions cellulaires aberrantes induites. Ici, nous présentons ces approches comme preuve de la façon dont la combinaison des techniques relativement standard et largement utilisé permet l'examen du moment de l' expression du gène sort dans le développement de progéniteurs rétiniens ^{8, 9.}

Ce protocole décrit une approche expérimentale combinant imagerie time-lapse avec la facilité de parformant la transplantation dans l'ex vivo développement embryon de poisson zèbre à suivre mosaically individuelle des cellules marquées pendant toute la période de rétinogenèse développement. En effectuant des manipulations génétiques fonctionnels, soit dans l'embryon hôte, donneur de l'embryon, les deux ou aucun, on peut évaluer l'autonomie de la cellule de la fonction des gènes. Cette approche peut être adaptée largement aux questions de recherche similaires dans tout autre système pour lequel les composants individuels décrits ici sont appropriés.