Summary

Een op maat HPLC Zuivering Protocol dat zijn vruchten High-zuiverheid Amyloïd Beta 42 en Amyloid Beta 40 Peptiden, in staat oligomeervorming

Published: March 27, 2017
doi:

Summary

Hierin beschrijven we een speciaal HPLC zuiveringsprotocol hoogzuivere amyloïde beta 42 (Aß42) en amyloïde beta 40 (Aβ40) peptiden, kunnen oligomeervorming oplevert. Amyloid beta is een zeer gevoelig aggregatie, hydrofoob peptide betrokken bij de ziekte van Alzheimer. De amyloidogenic aard van het peptide maakt de zuivering ervan een uitdaging.

Abstract

Amyloidogenic peptides such as the Alzheimer’s disease-implicated Amyloid beta (Aβ), can present a significant challenge when trying to obtain high purity material. Here we present a tailored HPLC purification protocol to produce high-purity amyloid beta 42 (Aβ42) and amyloid beta 40 (Aβ40) peptides. We have found that the combination of commercially available hydrophobic poly(styrene/divinylbenzene) stationary phase, polymer laboratory reverse phase – styrenedivinylbenzene (PLRP-S) under high pH conditions, enables the attainment of high purity (>95%) Aβ42 in a single chromatographic run. The purification is highly reproducible and can be amended to both semi-preparative and analytical conditions depending upon the amount of material wished to be purified. The protocol can also be applied to the Aβ40 peptide with identical success and without the need to alter the method.

Introduction

De ziekte van Alzheimer is een neurodegeneratieve aandoening die wereldwijd gevolgen meer dan 35 miljoen mensen. 1 sterk Betrokken bij het ontstaan en de ontwikkeling van de ziekte, is het zeer gevoelig aggregatie, hydrofoob peptide Amyloid beta (Aß). 2 Aß varieert 36-43 aminozuren lang, echter, wordt gedacht dat de 42-aminozuur variant amyloïde beta 42 (Aß42), is de meest giftige vorm van het eiwit. 3 Dit heeft in hoofdzaak het vermogen van Aß42 gemakkelijk vormen diffundeerbare, oligomere species die geacht worden bijzonder neurotoxische entiteiten. 4 Om ons begrip van het Ap-peptide te bevorderen, is het essentieel om routinematig bekomen hoge zuiverheid materiaal. De aanwezigheid van sporen verontreinigingen is aangetoond dat drastisch veranderen de aggregatie neiging eigenschappen van het peptide. 5

Traditionally, heeft de hoge prestatie vloeistofchromatografie (HPLC) scheiding van hydrofobe peptiden zoals Aß gedaan door het gebruik van een combinatie van C 4 of C-8 silica gebaseerde vaste fasen en een zure mobiele fase. 6 kan evenwel omstandigheden een uitdaging voor de zuivering van het peptide. De lage isoelektrische punt van het Aß peptide (pI ongeveer 5,5) 7 betekent dat onder zure omstandigheden, peptide aggregatie verhoogd en daardoor breed, niet opgeloste HPLC pieken die vaak moeilijk te isoleren zijn geproduceerd (Figuur 2A). Bovendien is een dergelijke brede pieken bevatten vaak verontreinigingen die de aggregatie profiel van het peptide van invloed kunnen zijn, en vaak vereisen daaropvolgende ronden van zuivering die dramatisch kan invloed hebben op de hoeveelheid peptide geproduceerd.

De poly (styreen / divinylbenzeen) stationaire fase PLRP-S, vertegenwoordigt een alternatieve purifying hydrofobe peptiden. De stationaire fase is gebruikt bij de zuivering van een aantal verschillende eiwitten en messenger ribonucleïnezuren (mRNA). 8, 9 De PLRP-S stationaire fase vereist geen extra alkyl ligand voor omgekeerde fasescheiding en vooral chemisch stabiel is bij hoge pH die leidt tot disaggregatie van het peptide. 7 Hierin vermelden wij een op maat gesneden HPLC zuivering protocol dat hoge zuiverheid amyloïde beta 42 (Aß42) en amyloïde beta 40 (Aβ40) peptiden oplevert.

Protocol

1. Preparatieve HPLC Zuivering van de Aβ40 of Aß42 Peptide Bereid de volgende buffers voor HPLC zuivering. Bereid buffer A (20 mM NH 4 OH) door toevoeging van 1,3 ml NH4OH (28% oplossing) tot 1000 ml ultrazuiver water. Bereid buffer B (80% acetonitril met 20 mM NH 4 OH) door toevoeging van 1,3 ml NH4OH (28% oplossing) aan een oplossing van 800 ml HPLC kwaliteit acetonitril en 200 ml ultrazuiver water. Bereid monster bu…

Representative Results

De zuivering van de Aß42-peptide met een combinatie van de PLRP-S stationaire fase en een hoge pH mobiele fase resulteert in de vorming van een scherpe, opgelost piek voor het Aß-peptide bij een verblijftijd tussen 72 en 74 min (figuur 2C). Bevestiging van de identiteit van de piek wordt gedaan door middel van directe injectie massaspectrometrie van de verzamelde eluens. Het eluens kan worden opgeslagen bij -20 ° C in oplossing tot 12 uur. Langere opslag kan leiden to…

Discussion

De HPLC zuivering van het Aß peptide hangt sterk af van de keuze van zowel de stationaire fase in de zuivering en de mobiele fase gekozen om het peptide te elueren. De lage isoelektrische punt van het peptide en hoge neiging tot aggregatie render traditionele chromatografische omstandigheden voor de scheiding van hydrofobe eiwitten (C4 en C8 stationaire fase in combinatie met een zuur mobiele eluens) uitdagend, met het Aß peptide geëlueerd als een verlengde breed, niet-opgelost piek (Figuur 2A).

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs willen graag Agilent bedanken voor hun technische bijstand. Kate Markham en Rafael Palomino worden gecrediteerd voor hun eerste hulp bij de synthese en zuivering van het AP-peptide en dr Hsiau-Wei Lee wordt bedankt voor zijn hulp bij de voorbereiding van figuur 1 van het manuscript.

Materials

Agilent 1260 Infinity II quarternary pump Agilent G7111B http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-pumps-vacuum-degassers/1260-infinity-ii-quaternary-pump
Agilent 1260 Infinity II Dual variable wavelength detector Agilent G7114A http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-detectors/1260-infinity-ii-variable-wavelength-detector
Agilent 1260 Infinity II Manual Injector fitted with 10 mL stainless steel sample loop Agilent 0101-1232 http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-injection-systems/1260-infinity-ii-manual-injector
Agilent 1260 Infinity II Manual Injector fitted with 20 µL stainless steel sample loop Agilent G1328C http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-injection-systems/1260-infinity-ii-manual-injector
Ring Stand Mounting Bracket Agilent 1400-3166
PEEK Tubing Blue (1/32" outer diameter х 0.010" internal diameter) Thermo Scientific 03-050-399
Agilent PLRP-S 300Å 8µm 25 х 300 mm column (Preparative) Agilent PL1212-6801 http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-columns/biomolecule-separations/plrp-s-for-biomolecules#features
Agilent PLRP-S 300Å 8µm 7.5 х 300 mm (Semi-Preparative) Agilent PL1112-6801 http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-columns/biomolecule-separations/plrp-s-for-biomolecules#features
Agilent PLRP-S 300Å 5 µm 4.6 x 250 mm (Analytical) Agilent PL1512-5501 http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-columns/biomolecule-separations/plrp-s-for-biomolecules#features
Aβ42 or Aβ40 peptide Synthesized in-house using a CEM liberty automated peptide synthesizer.
Ammonium Hydroxide (NH4OH, 28% solution) Fisher Scientific A669-500
Acetonitrile Fisher Scientific A998-4
HPLC grade water Fisher Scientific W5-4
Falcon 50 ml conical centrifuge tube Fisher Scientific 14-954-49A
Supelco PEEK Fitting One-piece fingertight, pkg of 5 ea Sigma-Aldrich Z227250
Normject 5cc sterile syringe Fisher Scientific 1481729
16 Gauge SS Needle Rheodyne 3725-086

Referencias

  1. Querfurth, H. W., LaFerla, F. M. Alzheimer’s Disease. N. Engl. J. Med. 362 (4), 329-344 (2010).
  2. McGowan, E., et al. Aβ42 Is Essential for Parenchymal and Vascular Amyloid Deposition in Mice. Neuron. 47 (2), 191-199 (2005).
  3. Gong, Y., et al. Alzheimer’s disease-affected brain: Presence of oligomeric Aβ ligands (ADDLs) suggests a molecular basis for reversible memory loss. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (18), 10417-10422 (2003).
  4. Selkoe, D. J. Soluble Oligomers of the Amyloid β-Protein Impair Synaptic Plasticity and Behavior. Behav Brain Res. 192 (1), 106-113 (2008).
  5. Zagorski, M. G., Yang, J., Shao, H., Ma, K., Zeng, H., Hong, A. Methodological and Chemical Factors Affecting Amyloid β Peptide Amyloidogenicity. Methods Enzymol. 309, 189-204 (1999).
  6. Kim, W., Hecht, M. H. Mutations Enhance the Aggregation Propensity of the Alzheimer’s Aβ Peptide. J Mol Bio. 377 (2), 565-574 (2008).
  7. Fezoui, Y., et al. An improved method of preparing the amyloid beta-protein for fibrillogenesis and neurotoxicity experiments. Amyloid. 7 (3), 166-178 (2000).
  8. Zhelev, N. Z., Barratt, M. J., Mahadevan, L. C. Use of reversed-phase high-performance liquid chromatography on polystyrene-divinylbenzene columns for the rapid separation and purification of acid-soluble nuclear proteins. J Chromatogr A. 763 (1-2), 65-70 (1997).
  9. Thess, A., et al. Sequence-engineered mRNA Without Chemical Nucleoside Modifications Enables an Effective Protein Therapy in Large Animals. Mol Ther. 23 (9), 1456-1464 (2015).
  10. Warner, C. J. A., Dutta, S., Foley, A. R., Raskatov, J. A. Introduction of D-glutamate at a critical residue of Aβ42 stabilizes a pre-fibrillary aggregate with enhanced toxicity. Chem Eur J. 22 (34), 11967-11970 (2016).
  11. Thompson, J. A., Lim, T. K., Barrow, C. J. On-line High-performance Liquid Chromatography/Mass Spectrometric Investigation of Amyloid-β Peptide Variants Found in Alzheimer’s Disease. Rapid Commun. Mass Spectrom. 13 (23), 2348-2351 (1999).
  12. Layne, E. Spectrophotometric and turbidimetric methods for measuring proteins. Met. Enzymology. 3, 447-455 (1957).
  13. Ioannou, J. C., Donald, A. M., Tromp, R. H. Characterizing the secondary structure changes occurring in high density systems of BLG dissolved in aqueous pH 3 buffer. Food Hydro. 46, 216-225 (2015).
  14. Rahimi, F., Maiti, P., Bitan, G. Photo-Induced Cross-Linking of Unmodified Proteins (PICUP) Applied to Amyloidogenic Peptides. J. Vis. Exp. (23), e1071 (2009).
  15. Bitan, G., Kirkitadze, M. D., Lomakin, A., Vollers, S. S., Benedek, G. B., Teplow, D. B. Amyloid β-protein (Aβ) assembly: Aβ40 and Aβ42 oligomerize through distinct pathways. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (1), 330-335 (2003).

Play Video

Citar este artículo
Warner, C. J. A., Dutta, S., Foley, A. R., Raskatov, J. A. A Tailored HPLC Purification Protocol That Yields High-purity Amyloid Beta 42 and Amyloid Beta 40 Peptides, Capable of Oligomer Formation. J. Vis. Exp. (121), e55482, doi:10.3791/55482 (2017).

View Video