ברזולוציה גבוהה ניתוח החלקיקים יחיד מאת אלקטרונים Cryo-microscopy תמונות באמצעות SPHIRE
Summary
מאמר זה מציג פרוטוקול לעיבוד cryo-EM תמונות באמצעות חבילת תוכנה SPHIRE. הפרוטוקול הנוכחי יכול להיות מיושם עבור כמעט כל חלקיקים יחיד פרויקטים EM כי היעד ברזולוציה אטומית כמעט.
Abstract
SPHIX (SPARX למיקרוסקופ אלקטרונים ברזולוציה גבוהה) הוא קוד פתוח חדש, חבילת תוכנה ידידותית למשתמש לעיבוד אוטומטי למחצה של חלקיקים בודדים של קריאת מיקרוסקופ אלקטרונים (cryo-EM). הפרוטוקול המוצג כאן מתאר בפירוט כיצד להשיג מבנה אטומי ברזולוציה כמעט החל cryo-EM סרטים micrograph ידי הדרכת משתמשים בכל השלבים של צינור יחיד קביעת מבנה החלקיקים. צעדים אלה נשלטים מממשק המשתמש הגרפי החדש של SPHIRE ודורשים התערבות משתמש מינימלית. באמצעות פרוטוקול זה, מבנה 3.5 Å של TcdA1, מורכב רעלן Tc מ luminescens Photorhabdus , נגזר רק 9500 חלקיקים בודדים. גישה זו יעילה יעזור למשתמשים טירון ללא ניסיון עיבוד נרחב מידע מבניים מראש , כדי להשיג מודלים ללא אטום ללא רעש וללא משוא פנים של קומפלקסים macromolecular מטוהרים שלהם במדינה יליד.
Introduction
לאחר הפיתוח של טכנולוגיית גלאי האלקטרונים הישירה, ההתקדמות המדהימה של חלקיק יחיד cryo-EM כרגע עיצוב מחדש ביולוגיה מבנית 1 . לעומת קריסטלוגרפיה רנטגן, טכניקה זו דורשת רק כמות קטנה של חומר חלבון ללא צורך התגבשות, בעת ובעונה אחת מציב פחות מגבלות לגבי טוהר המדגם ועדיין המאפשר קביעת מבנים ברזולוציה אטומית כמעט. חשוב לציין, קומפוזיציות או מדינות שונות יכולות כעת להיות מופרדות באופן חישובי וקביעת המבנה של הקונפורמיות השונות יכולה להתבצע ברמה חסרת תקדים של פירוט. לאחרונה, מפות צפיפות של מולקולות מאתגרות יכול להיות מיוצר על החלטות המאפשר בניית מודל novo ובכך הבנה עמוקה של מצב הפעולה שלהם 2 , 3 , 4 , 5.
מגוון רחב של עיבוד תמונה חבילות תוכנה זמינים 3DEM (3D אלקטרונים מיקרוסקופיה) הקהילה (https://en.wikibooks.org/wiki/Software_Tools_For_Molecular_Microscopy) ורובם נמצאים תחת פיתוח מתמשך. רזולוציה כמעט אטומית הושגה עבור חלבונים המציגים משקולות מולקולריות שונות וסימטריות עם מספר חבילות תוכנה שונות, כולל EMAN2 6 , IMAGIC 7 , FREALIGN 8 , RELION 9 , SPIDER 10 ו- SPARX 11 . כל חבילה דורשת רמה אחרת של מומחיות המשתמש ומספקת רמה אחרת של הדרכה למשתמש, אוטומציה והרחבה. יתר על כן, בעוד כמה תוכניות לספק סביבות מלאות כדי להקל על כל השלבים של ניתוח התמונה, אחרים נועדו לייעל משימות ספציפיות, כגון חידוד של פרמטרים יישור החל מ r ידועמבנה האספקה. לאחרונה, פותחו מספר פלטפורמות, כולל APPION 12 ו- SCIPION 13 , המספקות צינור עיבוד יחיד המשלב גישות ופרוטוקולים מחבילות התוכנה השונות המפורטות לעיל.
כדי לתרום לפיתוח הנוכחי של cryo-EM, SPARX פותחה מחדש לתוך פלטפורמת עצמאית חדשה מלאה עבור ניתוח חלקיקים בודדים, הנקראת SPHIRE (SPARX למיקרוסקופ אלקטרונים ברזולוציה גבוהה). על מנת להגביר את הנגישות של הטכניקה לחוקרים חדשים בתחום ולהתמודד עם כמות גדולה של נתונים המיוצרים על ידי מיקרוסקופים אלקטרונים מודרניים לחלוטין אוטומטיים מתקדמים, צינור העיבוד עוצב מחדש ופשוט על ידי הצגת קל לשימוש ממשק משתמש גרפי (GUI) ואוטומציה של השלבים העיקריים של זרימת העבודה. יתר על כן, אלגוריתמים חדשים נוספו כדי לאפשר מהיר, לשחזור אוטומטי קביעת מבנה מ crYo-EM תמונות. יתר על כן, אימות על ידי reproducibility הוכנס על מנת למנוע artifacts משותף המיוצר במהלך חידוד וניתוח הטרוגניות.
למרות שהתוכנית השתנתה במידה ניכרת, תכונות הליבה המוערכות שלה נשמרו: קוד פתוח של קוד פתוח, עיצוב מודרני מונחה עצמים וממשקי Python עבור כל הפונקציות הבסיסיות. לכן, זה לא השתנה לתוך תוכנית קופסה שחורה, המאפשר למשתמשים ללמוד בקלות לשנות את קוד Python, כדי ליצור יישומים נוספים או לשנות את זרימת העבודה הכוללת. זה שימושי במיוחד עבור פרויקטים שאינם סטנדרטיים cryo-EM.
כאן אנו מציגים פרוטוקול להשגת מפת אטומי ברזולוציה אטומית כמעט מ cryo-EM תמונות באמצעות GUI של SPHIRE. הוא מתאר בפירוט את כל השלבים הנדרשים כדי ליצור מפה צפיפות מ cryo-EM ישיר גלאי סרטים אינו מוגבל לכל סוג מקרומולקולה מסוים. פרוטוקול זה בעיקר מתכוונת להדריך newcOmers בתחום באמצעות זרימת עבודה ולספק מידע חשוב על צעדים מכריעים של העיבוד, כמו גם כמה מכשולים אפשריים ומכשולים. תכונות מתקדמות יותר ואת הרקע התיאורטי מאחורי SPHIRE יתוארו במקומות אחרים.
Protocol
Representative Results
Discussion
חלקיק יחיד cryo-EM הראו התפתחות מהירה בשנים האחרונות ומסירת מבנים ברזולוציה אטומית רבים של קומפלקסים macromolecular של משמעות ביולוגית גדולה 25 . כדי לתמוך במספר גדול של משתמשים מתחילים, כי כרגע הם נכנסים לשדה, פיתחנו את החלקיקים תמונה אחת ניתוח פלטפורמת SPHIRE ולהציג כאן פרוטוקול דרך לאורך כל העבודה כולל יישור הסרט, בחירת החלקיקים, הערכה CTF, המודל הראשוני חישוב, 2D ו 3D ניתוח הטרוגניות, ברזולוציה גבוהה 3D חידוד ואומדן ברזולוציה המקומית וסינון.
הפרוטוקול המתואר כאן נועד כמדריך קצר לקביעת מבנה 3D באמצעות microoraphs cryo-EM של החלבון של עניין ועם עזרה של כלי חישוב הניתנים על ידי GUI עצמאית של SPHIRE.
התכונה העיקרית של זרימת העבודה היא כי ביותרשל נהלים צריך להיות מופעל רק פעם אחת, שכן הם מסתמכים על הרעיון של אימות על ידי reproducibility 19 ו אינם דורשים פרמטר tweaking. מנגנון אימות אוטומטי זה הוא היתרון העיקרי של SPHIRE על גבי חבילות תוכנה אחרות מאז התוצאות נוטות להיות אובייקטיביות כמו גם לשחזור, והכי חשוב, להשגה במחיר חישוב מקובל. צינור מספק בנוסף שפע של מידע אבחון עבור משתמשים מנוסים לבצע אימות עצמאית נוספת עם שיטות משלו. עם זאת, משתמש טירון שיש לו לפחות רקע תיאורטי בסיסי ביולוגיה מבנית ומיקרוסקופ אלקטרונים אמור להיות מסוגל לקבל מבנים ברזולוציה אטומית כמעט באמצעות נתונים משלו ואת הליכי אימות אוטומטיים.
עם זאת, קבלת מבנה ברזולוציה אטומית כמעט לא תמיד פשוטה והתוצאה תהיה תלויה מאוד באיכות המדגם ואת קלט datא. עבור הנהלים המוצגים כאן, ההנחה היא כי כמות מספקת של סרטים באיכות גבוהה גלם לא משויך EM זמינים, עם ממוצעים שלהם מראה בבירור חלקיקים הומוגניים יחיד מכוונת אקראית. באופן כללי, אין מגבלות לגבי הסימטריה, הגודל או הצורה הכוללת של המולקולה, אך משקל מולקולרי נמוך יכול להיות גורם מגביל, במיוחד כאשר לחלבון יש צורה גלובלית חסרת תכונות. בדרך כלל, ניתוח של חלקיקים גדולים, מסודרים היטב עם סימטריה קבוצתית גבוהה הוא פחות תובעני. לכן, זה מאוד ממליץ למשתמשים מתחילים להפעיל את הפרוטוקול הנוכחי הראשון עם מאופיין היטב cryo-EM dataset. או את הנתונים SPHIRE הדרכה (http: /sphire.mpg.de) או אחד הנתונים EMPIAR שהוגשו (https://www.ebi.ac.uk/pdbe/emdb/empiar/) עם סרטים גולמיים הם נקודת התחלה טובה .
כאשר עיבוד הנתונים עצמו, סביר מאוד כי כמה מערכי נתונים או חלק מהתמונות לא יספק quali מסוימיםקריטריונים. בהקשר זה, בנוסף בדיקות אוטומטיות יציבות לשחזור, המבוצעת על ידי התוכנית בשלבים העיקריים של זרימת העבודה, הוא עדיין ממליץ למשתמשים לבחון ויזואלית את התוצאות "מחסומים" מסוימים של הפרוטוקול, במיוחד אם השחזור הסופי אינו מספק.
הבדיקה החזותית הראשונה יכולה להתבצע ברמת המיקרוגרף לאחר יישור הסרט ( שלב 2 בפרוטוקול) והערכת ה- CTF ( שלב 3 של הפרוטוקול). ממוצעים המתקבלים בתנועה, צריכים להראות בבירור חלקיקים בודדים המופרדים היטב, וספקטרום הכוח שלהם צריך להראות בבירור את הטבעות האיזוטרופיות. התדר המרחבי אליו הם נראים מגדיר, ברוב המקרים, את הרזולוציה הגבוהה ביותר שעליה ניתן לקבוע את המבנה באופן עקרוני בסופו של דבר. דוגמאות לממוצע מתוקן בתנועה של איכות מספקת וספקטרום הכוח שלה מוצגים בסעיף & #34. תוצאות נציג ".תמונות חריגות יותר אשר עשויה להיות השפעה שלילית על התוצאה הסופית ניתן להסיר בעזרת ספייר של להיסחף ו- CTF הערכה GUI כלים (http://sphire.mpg.de/wiki/doku.php).
לגבי ההקרנה החלקיקים, השלב המכריע בצינור SPHIRE הוא סיווג 2D באמצעות ISAC ( שלב 5.2 פרוטוקול) . כאן, המשתמש צריך לשלוט כי ממוצעים בכיתה 2 לשחזור מזוהות באופן אוטומטי על ידי התוכנית לאמץ מגוון של אוריינטציות מספיק כדי באופן שווה באופן שווה לכסות את המרחב הזוויתי. אם איכות ממוצעי הכיתה אינה משביעת רצון (תמונות רועשות ו / או מטושטשות) ו / או מספר ממוצעים בכיתה לשחזור הוא נמוך מאוד, שקול לשפר את איכות לקטוף אוטומטי, אופטימיזציה הדמיה dataset או הכנת המדגם. ברוב המקרים, לא ניתן לחשב שחזור אמין ממערכת נתונים שאינה מניבה ממוצעים מעמדיים דו-ממדיים טובים. דוגמאות של איכות גבוהה בכיתה 2 aveזעזועים מוצגים בסעיף "תוצאות נציג".
לפחות 100 ממוצעים מחלקה נדרשים כדי לקבל מודל תלת-ממד אמין ראשוני באמצעות RVIPER באופן אוטומטי ( שלב שלב 6.1 ). בשלב זה, המשתמש צריך לבחור את הממוצעים עם האיכות הגבוהה ביותר וכוללים כמו אוריינטציות שונות של החלקיקים ככל האפשר. איכות המודל הראשוני הוא קריטי להצלחתו של חידוד 3D ברזולוציה גבוהה.
בחבילות תוכנה אחרות, סיווג 3D מבוצע לעתים כדי להסיר "רע" חלקיקים 8 , 9 . עם זאת, ב SPHIRE רוב החלקיקים האלה בוטלו באופן אוטומטי כבר במהלך סיווג 2D באמצעות ISAC. לכן, מומלץ לבצע את שלב אינטנסיבית חישובית של מיון 3D רק אם השחזור ואת ניתוח השתנות 3D מצביעים על הטרוגניות של הנתונים.
והכי חשוב, המשתמש צריך תמיד לבדוק בקפידה את הכרכים 3D שהתקבלו בזהירות ( שלב שלב 9.3 ), ולאשר כי התכונות של צפיפות בהתאמה מסכימים היטב עם ההחלטה הנומינלית. ברזולוציה של <9 Å, צפיפות דמוית מוט המקביל ל α-סלסלות להיות גלוי. ברזולוציה <4.5 Å, צפיפות המקביל לגדילים ב β- גיליונות מופרדים בדרך כלל היטב חומצות אמינו מגושם להיות גלוי. מפה ברזולוציה גבוהה (<3 Å) צריכה להראות שרשראות צד ברורות, ובכך לאפשר בניית מודל אטומי מדויק.
תוצאות שהתקבלו עד כה להוכיח כי, בעזרת מבחני שחזור אוטומטי של SPHIRE בדיקות ויזואליות מינימלי, הפרוטוקול הנוכחי הוא ישים בדרך כלל לכל סוג של פרוייקט יחיד cryo-EM חלקיק. תוצאות נציג של כל שלב עיבוד מוצגים עבור שחזור של רעלן TCDA1 שלPhotorhabdus luminescens 21 , אשר נפתרה ברזולוציה אטומית כמעט. מפות צפיפות של איכות דומה ניתן להשתמש כדי לבנות מודלים אטומיים אמין על ידי השד נובו דה novo כמו גם עידון הדדי או שטח אמיתי, ובכך לספק מסגרת מבנית מוצק להבנת מנגנונים מולקולריים מורכבים.
קודי גישה:
הקואורדינטות עבור המבנה EM ואת הסרטים unprocessed הופקדו אלקטרונים מיקרוסקופית נתונים הבנק ואת מיקרוסקופית אלקטרונים פיילוט תמונה ארכיון תחת מספרי ההצטרפות EMD-3645 ו EMPIAR-10089, בהתאמה.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים ד רודרר על מתן לנו microdraphs TcdA1. אנו מודים לסטיב לודקה על תמיכתו המתמשכת בתשתית EMAN2. עבודה זו נתמכה על ידי קרנות של החברה מקס פלנק (ל SR) לבין המועצה האירופית במסגרת תוכנית המסגרת השביעית של האיחוד האירופי (FP7 / 2007-2013) (מענק מס '615984) (ל SR) ומענק של המכונים הלאומיים של בריאות R01 GM60635 ל PAP).
Materials
| SPHIRE | Max Planck Institute of Molecular Physiology- Dortmund and Houston Medical School, Houston, Texas | http://sphire.mpg.de | |
| UCSF Chimera | University of California, San Francisco | http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ | |
| Unblur | Janelia Farm Research Campus, Ashburn | http://grigoriefflab.janelia.org/unblur | |
| Coot | MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge | http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/ | |
| EMAN2 | Baylor College of Medicine, Houston | http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2 | |
| Computing Cluster with 1824 cores | Max Planck Institute of Molecular Physiology | Linux Cluster with 76 nodes, each with 2 Processors Xeon E5-2670v3 12C 2.30 GHz and 128 Gb RAM | |
| TITAN KRIOS electron microscope | FEI | 300 kV, Cs correction, XFEG | |
| Falcon II direct electron detector | FEI | ||
| EPU (automated data acquisition software) | FEI | https://www.fei.com/software/epu/ |
Referencias
- Nogales, E. The development of cryo-EM into a mainstream structural biology technique. Nature Methods. 13 (1), 24-27 (2016).
- Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy. Nature. 504 (7478), 107-112 (2013).
- Bai, X. -. C., Yan, C., et al. An atomic structure of human γ-secretase. Nature. 525 (7568), 212-217 (2015).
- Ecken, J. V. D., Heissler, S. M., Pathan-Chhatbar, S., Manstein, D. J., Raunser, S. Cryo-EM structure of a human cytoplasmic actomyosin complex at near-atomic resolution. Nature. 534 (7609), 724-728 (2016).
- von der Ecken, J., Müller, M., Lehman, W., Manstein, D. J., Penczek, P. A., Raunser, S. Structure of the F-actin-tropomyosin complex. Nature. 519 (7541), 114-117 (2015).
- Tang, G., Peng, L., et al. EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).
- van Heel, M., Harauz, G., Orlova, E. V., Schmidt, R., Schatz, M. A new generation of the IMAGIC image processing system. Journal of Structural Biology. 116 (1), 17-24 (1996).
- Grigorieff, N. FREALIGN: high-resolution refinement of single particle structures. Journal of Structural Biology. 157 (1), 117-125 (2007).
- Scheres, S. H. W. RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
- Shaikh, T. R., Gao, H., et al. SPIDER image processing for single-particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs. Nature Protocols. 3 (12), 1941-1974 (2008).
- Hohn, M., Tang, G., et al. SPARX, a new environment for Cryo-EM image processing. Journal of Structural Biology. 157 (1), 47-55 (2007).
- Lander, G. C., Stagg, S. M., et al. Appion: an integrated, database-driven pipeline to facilitate EM image processing. Journal of Structural Biology. 166 (1), 95-102 (2009).
- de la Rosa-Trevìn, J. M., Quintana, A., et al. Scipion: A software framework toward integration, reproducibility and validation in 3D electron microscopy. Journal of Structural Biology. 195 (1), 93-99 (2016).
- Grant, T., Grigorieff, N. Measuring the optimal exposure for single particle cryo-EM using a 2.6 Å reconstruction of rotavirus VP6. eLife. 4, 06980 (2015).
- Pettersen, E. F., Goddard, T. D., et al. UCSF Chimera?A visualization system for exploratory research and analysis. Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).
- Penczek, P. A., Fang, J., Li, X., Cheng, Y., Loerke, J., Spahn, C. M. T. CTER-rapid estimation of CTF parameters with error assessment. Ultramicroscopy. 140, 9-19 (2014).
- Frank, J. . Three-Dimensional Electron Microscopy of Macromolecular Assemblies. , (2006).
- Woolford, D., Ericksson, G., et al. SwarmPS: rapid, semi-automated single particle selection software. Journal of Structural Biology. 157 (1), 174-188 (2007).
- Yang, Z., Fang, J., Chittuluru, J., Asturias, F. J., Penczek, P. A. Iterative Stable Alignment and Clustering of 2D Transmission Electron Microscope Images. Structure/Folding and Design. 20 (2), 237-247 (2012).
- Gatsogiannis, C., Merino, F., et al. Membrane insertion of a Tc toxin in near-atomic detail. Nature Publishing Group. , (2016).
- Gatsogiannis, C., Lang, A. E., et al. A syringe-like injection mechanism in Photorhabdus luminescens toxins. Nature. 495 (7442), 520-523 (2013).
- Meusch, D., Gatsogiannis, C., et al. Mechanism of Tc toxin action revealed in molecular detail. Nature. 508 (7494), 61-65 (2014).
- Penczek, P. A., Frank, J., Spahn, C. M. T. A method of focused classification, based on the bootstrap 3D variance analysis, and its application to EF-G-dependent translocation. Journal of Structural Biology. 154 (2), 184-194 (2006).
- Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66, 486-501 (2010).
- Callaway, E. The revolution will not be crystallized: a new method sweeps through structural biology. Nature. 525 (7568), 172-174 (2015).
