SPHIRE를 사용한 전자 저온 현미경 이미지의 고해상도 단일 입자 분석

참고 :이 프로토콜을 따르려면 SPIRE를 MPI가 설치된 시스템 (현재 Linux 클러스터)에 올바르게 설치해야합니다. http://www.sphire.mpg.de에서 SPHIRE 및 TcdA1 데이터 세트를 다운로드하고 설치 지침을 따르십시오 : http://sphire.mpg.de/wiki/doku.php?id=howto:download. 이 절차는 EMAN2도 설치합니다. SPHIRE는 현재 입자 선택에 EMAN2의 e2boxer를 사용하고 이미지 파일을 표시하기 위해 e2 디스플레이를 사용합니다. 생체 현미경 영화의 선량 가중 모션 보정의 경우, SPHIRE는 언 블러 14를 사용 합니다. 프로그램을 다운로드하고 설치 지침 (http://grigoriefflab.janelia.org/unblur, Grigorieff lab)을 따르십시오. 결과 구조의 대화 형 시각화를 위해 프로토콜은 분자 그래픽 프로그램 인 Chimera 15 (https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html)를 사용합니다. 이 프로토콜에서 사용 된 기능에 익숙해지기위한 훌륭한 튜토리얼은nd here : https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/data/tutorials/eman07/chimera-eman-2007.html. SPHIRE GUI에서 클러스터에 병렬 작업을 제출하는 방법은 http://sphire.mpg.de/wiki/doku.php?id=howto:submissions에서 확인할 수 있습니다. SPHIRE GUI의 전반적인 구성과이 프로토콜 전반에 걸쳐 수행 된 워크 플로의 주요 단계가 그림 1 에 나와 있습니다. 1. PROJECT :이 프로젝트의 상수 매개 변수 값 설정 터미널 창에서 " sphire &" 를 입력하고 ENTER 키를 눌러 SPIRE GUI 응용 프로그램을 시작하십시오. 프로젝트 설정 페이지의 각 입력 필드에서 프로젝트 전체 매개 변수 ( 예 : 픽셀 크기, 입자 반경 및 대칭)를 조정 한 다음 워크 플로의 모든 후속 단계에 대해이 값을 등록하십시오. 왼쪽 패널의 오른쪽 아래에있는 "PROJECT"아이콘을 클릭하여 프로젝트 설정 페이지를 엽니 다. <li> e2display.py 이미지 대화 형 디스플레이 도구를 사용하여 입자의 가장 긴 축을 측정 한 다음 "Protein particle radius"에 입자 크기의 절반을 입력하십시오. 측정 단위가 Å이면 픽셀 크기를 사용하여 단위를 픽셀로 변환해야합니다 ( 예 : 입자 크기가 200 Å이고 픽셀 크기가 1.2 Å / 픽셀 인 경우 입자의 가장 긴 축은 200 / 1.2 = ~ 166 픽셀 및 반경 166/2 = 83 픽셀). "입자 상자 크기"를 입자 크기의 1.5 배 이상으로 설정하십시오. 큰 소수를 포함하는 창 크기를 피하십시오. 또한 3D 미세 조정 알고리즘에는 현재 짝수 번호의 상자 크기가 필요합니다. 참고 : 창에는 피킹 (창 내부의 입자 이동 필요) 및 적절한 CTF 보정을위한 입자 경계 외부의 충분한 배경 ​​영역 (특히 큰 초점 값에 중요)으로 인한 초기 중심 지정 오류를 설명하는 여백이 있어야합니다 <sup class = "xref"> 16). "CTF 창 크기"를 "입자 상자 크기"로 설정하십시오. 대비가 낮은 데이터가있는 프로젝트의 경우 큰 창을 사용하여 파워 스펙트럼을보다 부드럽게 추정하십시오. 복합체 ( 예 : "C5")의 "점대칭 대칭"을 설정합니다. 목표 구조의 대칭이 알려지지 않은 경우 "C1"(비대칭)으로 두십시오. 그러나 처리 중에 특정 고차 대칭이 나중에 식별되면이 대칭 설정을 적절히 변경하고 ISAC로 2D 정렬 후 단계를 반복합니다. "단백질 분자량"을 kDa로 설정하십시오 (대략적인 값으로 충분합니다). "Register settings"버튼을 누르십시오. 2. MOVIE : 각 Movie Micrograph의 프레임을 정렬하여 샘플의 전체 동작을 수정합니다. 모든 영화 현미경 사진에 대해 모든 프레임에 대해 x / y- 시프트를 계산 한 다음 도즈 – 비가 중 및 도우 – 가중치를 생성합니다.평균 보정 (Discussion 참조). CTF 추정은 선량 가중 평균에서는 잘 수행되지 않지만 후자는 구조 결정의 다른 모든 단계에서 사용되기 때문에 전자는 CTF 추정에만 필요하다는 점에 유의하십시오. "MOVIE"아이콘을 클릭하고 "Micrograph Movie Alignment"버튼을 클릭하십시오. 실행 파일을 선택하여 "실행 가능 경로 차단 해제"를 설정하십시오. 정렬되지 않은 원시 현미경 사진을 선택하고 파일 이름의 가변 부분을 와일드 카드 "*"( 예 : TcdA1 _ *. mrc)로 대체하여 "입력 현미경 경로 패턴"을 설정하십시오. "출력 디렉토리"에 대한 경로를 지정하십시오. 실행 파일을 선택하여 "Summovie executable path"를 설정하십시오. "영화 프레임 수"를 각 영화 현미경 사진의 프레임 수로 설정하십시오. "현미경 전압"및 "프레임 당 노출"을 데이터 수집 중에 사용되는 값으로 설정하십시오. (예 :전체 노출량이 60 e – / Å 2 이고 사전 노출없이 20 프레임을 기록한 경우 모든 프레임의 노출은 60 / 20 = 3 e – / A 2 입니다.) "명령 실행"버튼을 눌러 각 영화 현미경 사진의 프레임. 참고 : 이것은 자동으로 선량 비가 중 및 선량 가중의 모션 보정 평균 현미경 사진을 포함하는 두 개의 출력 디렉토리를 만듭니다. 3. CTER : CTF의 디 포커스 및 난시 매개 변수 추정 각각의 선량 – 비가 중 평균 현미경 사진에 대해 CTF 매개 변수 (초점 흐림 및 난시, 다른 것은 사용자가 설정 함)를 추정합니다. "CTER"아이콘을 클릭하고 "CTF Estimation"버튼을 클릭하십시오. "입력 현미경 경로 패턴"을 설정하려면 선량 – 비가 중 움직임 보정 현미경 그래프를 선택한 다음 파일 이름의 변수 부분을 와일드 카드로 대체하십시오"*". 또한 "출력 디렉터리"의 경로를 지정하십시오. "진폭 대비"는 실험실에서 데이터의 종류 (얼음 두께가 주요 요인 임) 및 현미경 전압 ( 예 : 10 %)에 대해 일상적으로 사용되는 값으로 설정합니다. 일반적인 값은 7 – 14 % 범위입니다. 데이터 수집 중에 "현미경 구면 수차 (Cs)"및 "현미경 전압"을 설정합니다. CTF 모델 피팅의 검색 범위의 "최저 주파수"와 "최고 주파수"를 각각 0.0285와 0.285Å -1 (40 – 4Å)로 설정하십시오. "Run command"버튼을 눌러 CTF 매개 변수를 추정하십시오. 참고 : CTF 매개 변수는 지정된 출력 디렉토리의 partres.txt 파일에 자동으로 저장됩니다. 112 개의 현미경 사진에 대한 CTF 추정은 96 개의 코어에서 계산되었고 대표 결과를 얻기 위해 사용 된 Linux 클러스터에서 ~ 3 분 후에 완료되었습니다. 4. 창 : 선량 – 가중 평균 현미경 사진에서 입자 추출 e2boxer 6 을 사용하여 현미경 사진에서 입자를 수동 또는 자동으로 선택하고 각각 관련 현미경 사진 내의 입자 xy 좌표 목록이 포함 된 좌표 파일을 만듭니다. "WINDOW"아이콘을 클릭하고 "Particle Picking"버튼을 클릭하십시오. "Run command"버튼을 눌러 e2boxer 6 를 시작하고 수동 또는 자동으로 각 현미경 사진의 입자를 선택하십시오 18 ( 토론 참조). 각 현미경 사진의 최종 입자 좌표를 EMAN1 파일 형식 (.box)으로 저장하십시오. 또는 다른 프로그램에서 좌표 파일을 EMAN1 형식으로 변환 한 후 가져 오십시오. 선량 가중 현미경 사진에서 입자 이미지를 추출하여 입자 스택을 만듭니다 (SPHIRE에서는 입자 스택이 없습니다).단순히 "스택"이라고 부름). "Particle Extraction"버튼을 누르십시오. 선량 가중치가 적용된 이동 현미경 사진을 선택한 다음 파일 이름의 변수 부분을 와일드 카드 "*"( 예 : TcdA1 _ *. mrc)로 바꾸어 "입력 현미경 경로 패턴"을 지정하십시오. 마찬가지로 좌표 파일 ( 예 : TcdA1 _ *. 상자)을 선택하여 "좌표 입력 경로 패턴"을 설정하십시오. "출력 디렉토리"에 대한 경로를 지정하십시오. CTF 매개 변수 파일 (단계 3.1에서 생성 된 partres.txt)을 선택하여 "CTF 매개 변수 원본"을 설정하십시오. "Run command"버튼을 누르십시오. 추출 된 입자 이미지 스택을 하나의 이미지 스택으로 결합합니다. "Particle Stack"버튼을 클릭하십시오. BDB 파일 경로 형식 ( 예 : "bdb : Particles / stack", 여기서 "Particles"는 th를 가리킴)을 사용하여 "가상 이미지 스택 출력"경로를 지정하십시오e 디렉토리는 이름이 항상 EMAN2DB 인 BDB 데이터베이스 디렉토리를 포함하고 "스택"은이 데이터베이스 내의 특정 이미지 스택을 참조합니다. "mpi_proc"로 시작하는 디렉토리를 선택한 다음 디렉토리 이름의 가변 부분을 와일드 카드 "*"( 예 : Particles / mpi_proc_000 to Particles / mpi_proc_ *)로 대체하여 "Input BDB image stack pattern"을 지정하십시오. "Run command"버튼을 누르십시오. 5. ISAC : 2D에서 입자 이미지의 분류 입자를 정렬하고 2D 모양에 따라 클러스터링하여 2D 클래스 평균을 계산합니다. 참고 : 결과 2D 평균은 개별 입자 이미지와 비교하여 향상된 신호 대 잡음비 (SNR)를 가지므로 데이터 집합의 품질과 이질성을 시각적으로 평가하고 스택에서 바람직하지 않은 이미지를 분류하는 데 사용됩니다 ( 예 : 얼음 결정, 탄소 가장자리,응집물, 파편 등 ) 19 . 또한 초기 3D 모델을 결정하는 데 사용됩니다. "ISAC"아이콘을 클릭하고 "ISAC – 2D 클러스터링"버튼을 클릭하십시오. 추출 된 입자가 포함 된 스택 파일을 선택하여 "입력 이미지 스택"을 설정하십시오. "출력 디렉토리"에 대한 경로를 지정하십시오. "클래스 당 이미지"는 200 – 1000을 사용하십시오. 예상되는 2D 클래스 수 (클래스 당 이미지 수로 나눈 총 입자 수)를 고려하여 적절한 수를 선택하십시오. SNR 및 데이터 세트의 크기에 따라이 매개 변수를 조정하십시오. 데이터 세트가 지나치게 시끄러운 경우 클래스 당 멤버 수를 늘립니다. 적은 수의 파티클을 사용할 수있는 경우 숫자를 줄입니다. 참고 : 메모리 제한 때문에 다소 큰 데이터 세트 (> 100,000 개 입자)의 경우 전체 데이터 세트를 하위 세트로 분할하고 각 하위 세트에 대해 ISAC를 개별적으로 수행 한 다음 결합결국 결과. 이 처리 시나리오에 대한 자세한 지침은 http://www.sphire.mpg.de/wiki/doku.php에 나와 있습니다. "위상 반전"확인란을 선택하십시오. 이러한 설정으로 모든 입자 이미지를 자동으로 축소하여 프로세스 속도를 높이려면 "대상 입자 반경"및 "대상 입자 이미지 크기"의 기본값을 유지하십시오. "Run command"버튼을 눌러 2D 클래스 평균을 계산하십시오. 참고 :이 단계는 계산적으로 까다로운 작업이며 입자 및 클래스 수 및 대상 반경 및 이미지 크기에 따라 실행 시간이 크게 늘어납니다. 96 개의 프로세스가있는 클러스터에서 ~ 10,000 입자의 2D 분류는 약 90 분 후에 완료됩니다. 결과 ISAC 2D 평균을 표시하고 시각적으로 검사하여 품질이 만족 스러운지 확인하십시오 (토론 참조). "UTILITIES"아래의 "Display Data"버튼을 누릅니다. 세트 "입력 파일 "을 선택합니다 (5.1 단계에서 생성 한 class_averages.hdf)."실행 명령 "버튼을 눌러 ISAC에서 제공하는 최종 재생 가능 및 유효 클래스 평균을 표시하십시오. 검증 된 클래스 평균의 파티클 멤버 만 포함하는 새 스택을 만듭니다. "Create Stack Subset"버튼을 누릅니다. 5.1.1 절과 같은 스택 파일을 선택하여 "입력 이미지 스택"을 설정하십시오. ISAC 2D 평균 (단계 5.1에서 생성 한 class_averages.hdf)을 선택하여 "ISAC 평균"을 설정하십시오. "출력 디렉토리"에 대한 경로를 지정하십시오. "Run command"버튼을 누르십시오. 6. VIPER : 초기 3D 모델 계산 불량한 모든 클래스 평균과 파티클의 동일한 뷰를 삭제하고 (Discussion 참조) 클래스 평균 (100 개 이상 이미지)의 작은 세트를 선택하고 담당자를 계산하는 데 사용합니다VIPER를 이용한 초기 모델. 선택 사항에는 ~ 200-500 명의 구성원이 각각 60-80 개의 고품질 평균을 포함해야합니다. "VIPER"아이콘을 클릭 한 다음 "데이터 표시"버튼을 클릭하십시오. ISAC 2D 평균 (5.1 단계에서 생성 한 class_averages.hdf)을 선택하여 "입력 파일"을 설정하십시오. "Run command"버튼을 누르십시오. e2display의 그래픽 창에서 마우스 중간 버튼을 누르고 팝업 창에서 "DEL"버튼을 활성화하십시오. 모든 나쁜 클래스 평균과 입자의 동일한 뷰를 삭제하십시오 ( 토론 참조). "Save"버튼을 눌러 나머지 2D 클래스 평균을 새 파일에 저장하십시오. 선택한 ISAC 평균에서 후속 3D 상세 검색을위한 초기 참조를 생성합니다. "초기 3D 모델 – RVIPER"버튼을 클릭하십시오. 스크린 클래스를 선택하여 "입력 이미지 스택"을 설정하십시오.평균 (단계 6.1에서 생성). "출력 디렉토리"에 대한 경로를 지정하십시오. ISAC 단계 5.1.3과 같은 "대상 입자 반경"에 대해 동일한 값을 사용해야합니다. 재생 가능한 ab initio 3D 모델을 생성하려면 "Run command"버튼을 누르십시오. 참고 :이 단계는 계산적으로 까다로운 작업이며 입자의 평균 수와 크기에 따라 실행 시간이 크게 늘어납니다. 96 개의 프로세스가있는 클러스터에서이 작업 (~ 100 개의 클래스 평균)은 ~ 15 분 후에 완료되었습니다. 클래스 평균 및 구조적 무결성 ( 즉 , 단절된 부품 및 / 또는 방향 인공물)을 고려하여 결과 3D 모델이 합리적인지 확인하십시오. 지도를 표시하려면 Chimera 15 프로그램을 사용하십시오. 이 시점에서 상 동성 단백질의 결정 구조 또는 관심있는 단백질의 도메인과의 첫 번째 비교를 수행하십시오 (예는 Represe결과). 후속 3D 미세 조정을 위해 주변 노이즈를 제거하고 원본 픽셀 크기와 일치하도록 다시 스케일링하여 초기 3D 참조 및 3D 마스크를 생성합니다. "Create 3D Reference"버튼을 클릭하십시오. ab initio 3D 모델 (단계 6.2에서 생성 된 average_volume.hdf)을 선택하여 "입력 음량"을 설정하십시오. "출력 디렉토리"에 대한 경로를 지정하십시오. ISAC 축소율 파일 (5.1 절에서 생성 한 README_shrink_ratio.txt)을 선택하여 "Resample ratio source"를 설정하십시오. "Run command"버튼을 누르십시오. 7. MERIDIEN : 초기 3D 볼륨 수정 초기 3D 모델에서 시작하여 3D 볼륨을 미세 조정합니다. "MERIDIEN"아이콘을 클릭 한 다음 "3D 상세 검색"버튼을 클릭하십시오. sele로 "입력 이미지 스택"및 "초기 3D 참조"설정입자 스택과 ab initio 3D 모델 (각각 5.3 및 6.4 단계에서 생성)을 사용합니다. "출력 디렉토리"에 대한 경로를 지정하십시오. 6.4 단계에서 생성 한 3D 마스크 파일을 선택하여 "3D 마스크"를 설정하십시오. 항상 3D 마스크를 사용하지만, 특히 초기 분석 단계에서는 잘못된 마스킹의 편향을 피하기 위해 구형 마스크 또는 참조에 느슨하게 맞춘 부드러운 가장자리의 마스크를 사용하십시오. "하드 2D 마스크 적용"체크 상자를 선택하십시오. "시작 해상도"를 20 – 25Å 사이의 컷오프 주파수 값으로 설정하십시오. 이 컷오프 주파수를 가진 로우 패스 필터는 초기 모델 바이어스를 줄이기 위해 초기 3D 구조에 적용됩니다. 이 프로세스에 사용 된 클러스터의 사양을 확인한 다음 "노드 당 메모리"를 사용 가능한 메모리 (GB)로 설정하십시오. "실행 명령"버튼을 누르면 완전 자동으로 초기 3D 모델에서 시작하는 3D 볼륨을 다듬을 수 있습니다. <br /> 참고 :이 절차에서는 데이터 세트를 두 개의 반으로 나눠서 두 모델을 개별적으로 구체화하고 입자의 절반에서만 두 개의 원시 볼륨을 출력합니다. 계산이 까다로 우며 작업 시간이 입자 수에 따라 크게 증가합니다. 이 클러스터에서 192 프로세스 (~ 8,000 입자, 352 상자 크기)에서 ~ 2.5 시간 실행 한 후에 자오선 정제가 완료되었습니다. 후속하는 선명 화 단계를 위해 세련된 볼륨에서 부드러운 가장자리의 3D 마스크를 만듭니다. "Adaptive 3D Mask"버튼을 클릭하십시오. 필터링되지 않은 하프 볼륨 (7.1 단계에서 생성) 중 하나를 선택하여 "입력 볼륨"을 설정하십시오. "출력 마스크"에 대한 경로를 지정하십시오. '이진화 임계 값'값을 설정하십시오. 키메라를 사용하여이 특정 임계 값에서 노이즈가 필터링되지 않은 절반 맵의 용매 영역에서 관심있는 볼륨 외부에 분명히 존재하고 단백질의 모든 밀도가 여전히 c인지 확인하십시오서로 연결되어있다. "실행 명령"버튼을 눌러 소프트 에지 3D 마스크를 만듭니다. 참고 : 결과 마스크의 본체 (값이> 0.5 인 복셀로 구성)는 입자 구조에 꼭 맞아야하지만 관심있는 모든 밀도를 여전히 포함해야합니다. 소프트 에지 제거는 최소 8-10 픽셀 너비 여야합니다. 3D 정제로 얻은 두 개의 필터링되지 않은 절반 볼륨을 병합합니다. 그런 다음, 검출기의 변조 전달 함수 (MTF), 추정 된 B- 인수 및 분해능의 FSC (푸리에 셸 상관 관계) 추정에 따라 전력 스펙트럼을 조정하여 병합 된 볼륨을 선명하게하십시오. "선명 화"버튼을 선택하십시오. 단계 7.1에서 생성 된 해당 파일 (vol_0_unfil.hdf 및 vol_1_unfil.hdf)을 선택하여 "필터링되지 않은 첫 번째 반 볼륨"및 "두 번째 필터링되지 않은 반 볼륨"을 설정하십시오. 항상 "B 요인 강화"를 사용하십시오. 일반적으로 e를 유지하려면 기본값을 유지하십시오.최종 분해능 주파수와 10Å 사이의 범위를 사용하여 입력 데이터 세트에서 B- 인자 값을 나타냅니다. 또는 임시 값 ( 예 : -100)을 지정하십시오. "로우 패스 필터 주파수"의 기본값을 유지하여 FSC 기반 필터를 적용하십시오. 단계 7.2에서 생성 된 3D 마스크를 선택하여 "사용자 제공 마스크"를 설정하십시오. 보고 된 해결책은이 마스크로 FSC를 사용하여 결정됩니다. "실행 명령"버튼을 눌러 세련된 3D 볼륨을 선명하게하십시오. 위의 3D 세분화 단계에 의해 추정 된 모든 입자의 투영 방향에서 3D 각도 분포도를 생성합니다. "Angular Distribution"버튼을 클릭하십시오. 파일 (7.1 단계에서 생성 된 final_params.txt)을 선택하여 "Alignment parameter file"을 설정하고 "Run command"버튼을 누릅니다. Chi를 사용하여 예리한 3D 모델을 육안으로 검사합니다.메라. 달성 된 해결책을 고려하여 구조가 합리적으로 보이는지 확인하십시오 ( 토론 참조). 시각적으로 키메라를 사용하여 각도 분포를 검사합니다. 배포판이 전체 3D 각도 공간을 대략 균등하게 커버하는지 확인하십시오. 대칭 구조의 경우 고유 한 비대칭 삼각형 내에서 분포가 제한된다는 점에 유의하십시오. 8. SORT3D : 가변성이 높은 영역을 중심으로 3D 이질성 정렬 3D 미세 조정에 사용 된 입자 스택에서 3D 가변성 맵을 계산합니다. "SORT3D"아이콘을 클릭하고 "3D Variability Estimation"버튼을 클릭하십시오. 3D 정제 단계 7.1.1에 주어진 것과 동일한 스크린 파티클 스택을 선택하여 "입력 이미지 스택"을 설정하십시오. "출력 디렉토리"에 대한 경로를 지정하십시오. "투영 수"의 기본값을 유지하십시오. 참고 : 각 이웃의 이미지후드는 각 3D 투영 각도에서 2D 분산을 추정하는 데 사용됩니다. 숫자가 클수록 예상치는 낮지 만 해상도와 회전 인공물이 더 낮습니다. "CTF 사용"확인란을 선택하십시오. "Run command"버튼을 누르십시오. 3D 변동성 맵을 사용하여 아래의 3D 클러스터링 단계에 대한 포커스 마스크를 만듭니다. "Binary 3D Mask"버튼을 선택하십시오. 3D 가변성 맵 (단계 8.1에서 생성)을 선택하여 "입력 음량"을 설정하십시오. "출력 마스크"의 파일 경로를 지정하십시오. 키메라의 "Volume Viewer"에서 "Level"필드의 출력을 사용하여 "Binarization threshold"를 설정하십시오. "Run command"버튼을 누르십시오. 구조적으로 매우 가변적 인 영역에 집중하여 입자 이미지를 균질 구조 그룹으로 정렬합니다. "3D 클러스터링 – RSORT3D"버튼을 누르십시오.3D 상세 검색 (7.1 단계에서 생성)의 출력 디렉토리를 선택하여 "3D 입체 디렉토리 입력"을 설정하십시오. "출력 디렉토리"에 대한 경로를 지정하십시오. 연약한 3D 마스크 (단계 7.2에서 생성)를 선택하여 "3D 마스크"를 설정하십시오. 이진화 된 3D 가변성 맵 (8.2 단계에서 생성)을 선택하여 "Focus 3D mask"를 설정하십시오. 대형 데이터 세트의 경우 "그룹당 이미지 수"에 5,000-10,000 이상을 사용하십시오. 이 프로그램은 그룹당 이미지 수를이 설정보다 항상 낮게 유지합니다. 예상되는 3D 그룹 수 ( "그룹당 이미지 수"값으로 나눈 입자의 총 수), 데이터 세트, SNR 및 이종 정도를 고려하여 값을 조정하십시오. 데이터 세트의 더 많은 수의 구별되는 구조적 상태가 예상되지 않는 한, 충분한 수의 파티클을 사용할 수 있다면 ~ 5-10 초기 3D 그룹부터 시작하십시오. "최소 그룹 크기"는 최소 3,000-5,000 개의 입자를 사용하십시오.프로그램은 "최소 그룹 크기"설정보다 적은 수의 이미지를 구성하는 그룹을 무시합니다. "실행 명령"버튼을 눌러 3D 클러스터링을 수행하십시오. 참고 : RSORT3D는 두 단계로 세분됩니다. 첫 번째 "sort3d"단계는 3D 이질성을 정렬합니다. 그런 다음 위의 3D 미세 조정 단계에서 결정된 3D 정렬 매개 변수를 사용하여 각 동질 구조 그룹의 볼륨을 재구성합니다. 두 번째 "rsort3d"단계는 두 개의 독립적 인 정렬 작업의 양방향 비교를 수행하여 각 그룹의 재현 가능한 구성원을 찾습니다. 그런 다음 재현 가능하게 할당 된 입자 만 사용하여 균질 구조를 재구성합니다. 96 코어의 클러스터에서는 약 3 시간 후에이 작업 (~ 8,000 입자, 352 상자 크기)이 완료됩니다. 프로그램이 끝나면 키메라를 사용하여 동종 3D 그룹을 선택하십시오. 가장 높은 겉보기 해상도의 구조를 선택하십시오. 일반적으로 가장 높은 해상도와 관련이 있습니다.pulous 그룹. 관심있는 단백질의 2D 클래스 평균 및 생물학적 측면을 고려하여 선택된 구조가 시각적으로 합리적인지 확인하십시오 ( 토론 참조). 유사한 해상도로 거의 동일한 구조를 가진 다른 볼륨이있는 경우 단일 동질 3D 그룹에서 나오는 것으로 간주하십시오. 가장 동 질적 인 3D 그룹의 파티클 멤버에 대해 (가장 높은 해상도로) 로컬 상세 검색을 수행합니다. "Local Subset Refinement"버튼을 클릭하십시오. 선택한 그룹의 파티클 ID를 포함하는 텍스트 파일을 선택하여 "서브 세트 텍스트 파일 경로"를 설정합니다 ( 예 : 8.3 단계에서 생성 한 Cluster0.txt). 이전 3D 상세 검색 (7.1 단계에서 생성)의 출력 디렉토리를 선택하여 "3D 상세 검색 디렉토리"를 설정합니다. "반복 반복"을 이전 3D 상세 검색에서 가장 높은 해상도를 얻은 곳으로 설정하십시오. 언론에"명령 실행"버튼을 클릭하면 선택한 입자 채우기에 대한 로컬 미세 조정을 수행 할 수 있습니다. 7.2 단계와 마찬가지로 로컬 서브 세트 세분화에 의해 재구성되지 않은 필터링되지 않은 최종 절반 볼륨에서 소프트 에지 3D (Soft-edged 3D) 마스크를 만듭니다. 7.3 단계와 마찬가지로 로컬 부분 집합 세분화에 의해 파생 된 두 개의 필터링되지 않은 마지막 절반 볼륨을 병합하고 병합 된 볼륨을 선명하게 만듭니다. 그러나 이번에는 예리한 볼륨을 필터링하지 마십시오. 주 : 단계 8.4의 이질성 분석이 비교 가능한 해상도에서 몇 가지 별개의 상태를 나타내면 모든 다른 상태를 개별적으로 다듬을 수 있습니다. 9. LOCALRES : 최종 3D 볼륨의 로컬 해상도 예측 균일 한 입자 집합에서 얻은 3D 볼륨의 로컬 해상도를 예측합니다. "LOCALRES"아이콘을 클릭하고 "Local Resolution"버튼을 클릭하십시오. "첫 번째 볼륨"및 "두 번째 볼륨(단계 8.5에서 생성 된) 로컬 서브 세트 세분화의 필터링되지 않은 최종 볼륨을 선택하여 "볼륨"을 선택합니다 8.6 단계에서 생성 된 소프트 에지 3D 마스크를 선택하여 "3D 마스크"를 설정하십시오 "출력 볼륨" . "FSC 창 크기"에 대한 기본값은 7 픽셀로 유지하십시오. 이 설정은 로컬 – 실제 공간 상관 관계가 계산되는 창의 크기를 정의합니다. 더 큰 창 크기는 로컬 분해능을 희생시키면서보다 매끄러운 해상도 맵을 생성합니다. 해상도 기준에 대해 "Resolution cut-off"의 기본값 0.5를 유지합니다. 참고 : 각 보셀에 대해 프로그램은 로컬 FSC가 선택한 해상도 임계 값 아래로 떨어지는 빈도로 로컬 해상도를보고합니다. 낮은 상관 관계 값은 높은 통계적 불확실성을 가지므로 0.5보다 낮은 임계 값은 권장하지 않습니다. 따라서 해당 로컬 해상도는 보셀간에 크게 달라집니다. "Overall resolution "을 선택하고 로컬 부분 집합 세분화 후 선명 화에서 추정 된 절대 해상도를 설정합니다 (단계 8.7)."실행 명령 "버튼을 눌러 볼륨의 로컬 해상도를 계산합니다. 3D 로컬 해상도 맵을 사용하여 로컬 하위 집합 구체화 이후에 선명하게 된 볼륨에 3D 로컬 필터를 적용합니다. "3D 로컬 필터"버튼을 클릭하십시오. 날카롭지 만 필터링되지 않은 3D 볼륨 (단계 8.7에서 생성)을 선택하여 "입력 볼륨"을 설정하십시오. 마찬가지로 "로컬 해상도 파일"및 "3D 마스크"(각각 9.1 및 8.6 단계에서 생성)를 설정합니다. 3D 마스크는 로컬 필터링이 적용될 영역을 정의합니다. "출력 볼륨"에 대한 파일 경로를 지정하십시오. "실행 명령"버튼을 눌러 3D 로컬 필터를 적용하십시오. 키메라를 사용하여 최종 3D 모델과 3D 로컬 해상도 맵을 시각적으로 검사합니다 (9.2 및 9.1 단계에서 생성, resp적극적으로). "표면 색상"옵션을 선택하여 로컬 해상도에 따라 3D 볼륨을 채 웁니다. 지역 결의안 배포는 원활해야합니다 ( 토론 참조).