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Medicina

Usando em Vitro viver-pilha de imagem para explorar Chemotherapeutics entregues por nanopartículas de lipídios-baseado

Published: November 01, 2017
doi:
10.3791/55405
,
1Laboratory Experimental Surgical Oncology, Section Surgical Oncology, Department of Surgery,Erasmus MC

Summary

Imagem latente da viver-pilha é uma poderosa ferramenta para visualizar processos dinâmicos. O exame das células fixos fornece apenas imagens estáticas, que podem levar a má interpretação e confusão sobre o processo. Este trabalho apresenta um método para estudar a absorção, liberação de drogas e localização intracelular de nanopartículas lipossomas em pilhas vivas.

Abstract

Técnicas de imagem convencionais podem fornecer informações detalhadas sobre processos celulares. No entanto, esta informação é baseada em imagens estáticas em um sistema contrário dinâmico e fases sucessivas são facilmente ignoradas ou mal interpretadas. Imagem latente da viver-pilha e microscopia de lapso de tempo, no qual as células vivas podem ser seguidas por horas ou mesmo dias de forma mais ou menos contínua, são, portanto, muito informativos. O protocolo descrito aqui permite a investigação do destino de nanopartículas de quimioterápicos após a entrega da doxorrubicina (dox) em células vivas. Dox é um agente intercalante que deve ser libertado da sua nanocarreador tornar-se biologicamente ativo. Apesar do seu registo clínico por mais de duas décadas, sua captação, colapso e liberação de drogas são ainda não totalmente compreendidas. Este artigo explora a hipótese de que nanopartículas de lipídios-baseado são ocupadas pelas células do tumor e são degradadas lentamente. Dox lançado então é translocada para o núcleo. Para evitar artefatos de fixação, imagem latente da viver-pilha e microscopia de lapso de tempo, descrito neste procedimento experimental, podem ser aplicados.

Introduction

A habilidade de seguir um processo biológico, tais como interações célula-célula, intere transporte intracelular, absorção de compostos citotóxica e interação da proteína-proteína de moléculas simples em células vivas e tecidos, ganhou grande interesse ao longo dos últimos década, pois fornece a dimensão extra de “tempo real”. Neste manuscrito, um método para seguir o destino intracelular de dox livre e dox incorporada em nanopartículas (Dox-NP) é descrito.

Nanopartículas tem sido usadas por décadas para tratar certos tipos de câncer. Dox-NP foi aprovado para o tratamento de sarcoma de Kaposi relacionadas com a SIDA, avançado dos ovário e da mama, cancro e mieloma múltiplo1. Foi um das nanopartículas lipossomas primeiras desenvolvido e introduzido na prática clínica. A forma livre, dox, vastamente estão desmarcada a circulação de sangue, limitando a sua capacidade para chegar ao local do tumor em quantidades suficientes. Além disso, o tratamento é acompanhado por severos e limitação de dose-efeitos colaterais, tais como estomatite e insuficiência cardíaca. Quando encapsulados em nanopartículas lipossomal peguilado o tempo de circulação aumenta minutos-dias2. Este tipo de colesterol contendo lipossomas é bastante estável e esta estabilidade determina a farmacocinética da droga encapsulada.

No entanto, esta rigidez tem uma desvantagem. A capacidade citotóxica de um composto para células tumorais é avaliado primeiro em vitro, e tem sido demonstrado que dox é mais potente do que Dox-NP em citotóxicos ensaios3,4. Foi hipotetisado que a estabilidade da transportadora impede a liberação e absorção celular da droga, e vale a pena investigar esse fenômeno ainda mais. As propriedades intrínsecas lipossomas, construídas para durar os elementos agressivos na corrente sanguínea e para chegar ao local do tumor intacto, resultaram na biodisponibilidade prejudicada do componente citotóxico (i.e., dox) no local de destino (ou seja, o tumor núcleo da célula). Embora Dox-NP hardily melhorou a resposta em comparação com a forma livre, era ainda de valor clínico, como encapsulamento reduziu significativamente a de efeitos cardiotóxicos5. Nos anos seguintes, outros compostos foram encapsulados em nano-transportadoras6. Também, modificar as transportadoras resultou na liberação de drogas desencadeada (i.e., no local do tumor), mas manteve estabilidade no sangue circulação7,8. Apesar de anos de investigação e uso clínico, o destino de intratumoral de nanocarriers como Dox-NP ainda não é inteiramente claro. Em uma recente publicação, foi demonstrado que as nanopartículas é retomada como um todo enquanto o dox originam-se do lisossomos9.

Absorção celular de uma liberação de nanopartículas e drogas são processos dinâmicos que melhor podem ser monitorados usando a imagem latente da viver-pilha. Além disso, a histologia clássica, em que as células são incubados e posteriormente corrigido, pode dar resultados falsos, se a fixação destrói o transportador lipossomal e introduz artefatos. O principal requisito para a imagem latente da viver-pilha é a visualização, de preferência por fluorescência, do processo desejado. Certos compostos, como dox, tem uma fluorescência vermelha intrínseca. Também, marcadores fluorescentes podem ser introduzidos a transportadora, e organelas da célula podem ser visualizadas usando marcadores de viver-pilha. Desta forma, uma matriz de parâmetros, como a absorção da transportadora, liberação de drogas e localização celular do portador e drogas, pode ser fotografada e analisada. Aqui, um método é descrito em que o destino intercelular da dox e Dox-NP em várias células tumorais é seguido em tempo real. Além disso, esse método pode ser facilmente adaptado para criar as condições ideais para o alvo (por exemplo, acusado de nanopartículas10) e provocou a liberação de drogas (por exemplo, hipertermia7).

Protocol

1. preparação montar a câmara de imagem, que consiste de duas partes. Colocar um vidro de tampa de 25 mm ( figura 1A -1) na parte inferior da câmara ( figura 1A -2) e o parafuso na parte superior na parte inferior ( figura 1A -3). Não aperte demais, pois o vidro pode quebrar. Autoclave a câmara inteira ( figura 1A -4). Preparar meio de cultura celular, completando Dulbecco ' s Modified Eagle ' s médio (DMEM), sem vermelho de fenol com 10% de soro de vitela fetal inactivados por calor (FCS) e 1 mM L-glutamina em condições estéreis. Loja a 4 ° C e quente a 37 ° C antes do uso. Manter as células com meio de cultura celular em cultivo balões, utilizando técnicas de cultura de célula padrão. Nota: Aqui, duas linhas de células de rato melanoma B16BL6 11 Lewis pulmão carcinoma (LLC) e dois melanomas humanos, BLM e 1F6 12, foram utilizados e. Fazer gelatina de 0,1% por pesagem e dissolver gelatina em tampão fosfato salino (PBS) a 37 ° C durante a noite. Esterilizar a solução por filtragem através de um filtro de 0,22 µm e armazená-lo em 4 ° C. 2. As células da placa remova a câmara de imagem do saco de esterilização em um fluxo laminar, cuidadosamente aperte a câmara e coloque-o em um prato de petri. Nota: Para evitar contaminação, manter a câmara de imagem em uma placa de Petri até a câmara pode ser colocada sob o microscópio. Revestir o vidro da câmara de imagem com 1 mL de gelatina estéril de 0,1% por 20 min a 37 ° C e 5% de CO 2. Nota: Isto permitirá que o melhor acessório de celular. Remover o meio dos frascos de cultura de células (consulte as etapas 1.2 e 1.3), lave uma vez com PBS 1x e separe as células usando a tripsina 0,25%. Inativar a tripsina pela adição de meio de cultura celular, coletar as células, girá-los para baixo a 1.100 x g por 5 min e resuspenda o pellet em 5 mL de meio de cultura celular. Diluir 20 µ l de suspensão de células com 20 µ l de trypan azul (que vai ser absorvido por células mortas). Contar o número de células vivas e mortas, usando um hemocytometer; o número de células mortas não deve exceder 10%. Aspirar a gelatina e as células em uma diluição que permite um máximo de 70% de cobertura no prazo de 24 h da placa. Por exemplo, use uma diluição de 5 x 10 4 ou 10 x 10 4 células em 1 mL. Permitir que as células a aderir em 5% de CO 2 e 37 ° C por 24 h. 3. Microscopia de lapso de tempo ( Figura 2) Nota: aqui, foi usado um microscópio confocal com um suporte de palco sob medida, embora a maioria dos fabricantes oferecem uma gama de incubadoras para viver-pilha de imagens que é também apropriado investigar a administração de medicamentos nanoparticulated. Avaliar as células sob um microscópio para confluência, morfologia celular e contaminação. Coloque a câmara de volta na incubadora 2 CO. Nota: A confluência não deve exceder 70%. Se a morfologia celular é inconsistente (ou seja, as células não aderem) ou contaminação é detectada, descartar a câmara de imagem. Ligar o microscópio confocal ( Figura 1E -1), luz fluorescente ( Figura 1E -2) e computador ( Figura 1E -3). Ligar o aquecedor de lente para o objectivo e configurá-lo para 35 ° C ( Figura 1E -4 + inserção). Preparar a unidade de incubação, conforme mostrado na figura 1B. Nota: Esta unidade consiste de uma fase aquecida ( figura 1B -1), uma fase de fluxo com um conector para os CO 2 tubos ( figura 1B -2) e CO 2 sonda ( figura 1B -3) e um patch de fechamento vermelho ( figura 1B -4). Este patch é usado para fechar temporariamente a unidade até a câmara de imagem é colocada. Coloque a unidade de incubação no palco microscópio e conectar os em – e out – flow CO 2 tubos ( Figura 1E -5). Abrir a válvula principal CO 2 ( Figura 1E -6) e ligue o CO 2 controlador ( Figura 1E -7). Verifique se o controlador for definido como 5% de CO 2. Nota: Para a umidade, o CO 2 passa por um umidificador ( Figura 1E -8). Para experimentos de hipóxia, um regulador de 2 O separado ( Figura 1E -9) está incluído no setup. Definir a temperatura da fase de 37 ° C ( Figura 1E -10). Para experiências de hipertermia, regule a temperatura de 42 ° C. permitir a unidade de incubação para atingir a temperatura seleccionada e o CO 2 percentagem. Levar a câmara de imagem da principal CO 2 incubadora e transportar a câmara em um prato de petri para a sala de microscopia. Coloque a câmara de imagem ( figura 1A -4) em uma custom-made, 35 mm de diâmetro estágio titular ( figura 1A -5) e fechar a câmara com uma tampa de vedação sob medida ( Figura 1A -6). Nota: A tampa permite CO 2 passar e impede a evaporação e contaminação. Abra a unidade de incubação, substituir o patch vermelho com a câmara de imagem e fechar a unidade ( Figura 1). Faça isso mais rápido possível para evitar o arrefecimento das células. Certifique-se de que os cabos não estão presos entre o palco e o microscópio. Deixar a unidade se adapte por 30 min. Abrir o software e ligue os lasers. Nota: Aqui, 488 argônio nm 543 nm hélio-neon, lasers 633 nm hélio-neon foram utilizados e. Fazer um novo banco de dados clicando em " nova " sob o nome de na guia arquivo e salve o banco de dados. Definir a configuração clicando " Config " sob o Tab. Acquire Select " modo de canal " e " única faixa " para avaliar um único fluoróforo ou " faixa Multi " para vários fluorophores. Selecione os filtros passa-faixa adequada correspondência o fluoróforo (filtro de passa-faixa , por exemplo, 560 para 615 da nm para dox e Dox-NP; Ver os resultados de representante para obter mais exemplos). Selecione o canal brilhante-campo em uma das faixas. Definir o controle de verificação clicando " Scan " sob o título o Tab. Acquire conjunto o tamanho do quadro (1.024 x 1.024), velocidade de digitalização (ideal), scan direção (8-bit, individual) e digitalizar média (4) clicando " modo. " definir o pinhole (200 µm), ganho e deslocamento ( por exemplo, 580, 700 e 835; Ver Figura 3) e o poder do laser (488 = 10%, 543 = 100%, 633 = 100%) clicando " canais. " salvar essas configurações clicando " Config " na configuração do guia e salvá-los no banco de dados de configuração. Definir o lapso de tempo clicando " Multi tempo X " ( Figura 1) na guia Macro clique " única localização ". Para manter as células em foco, selecione o foco automático na macro clicando " Auto foco… " Nota: Autofocus é conseguido com o laser de 633 nm, utilizando o reflexo do vidro como um ponto de referência. Aplicar a configuração salva clicando " única faixa " ou " Multi pista, " a rolagem para a configuração necessária no banco de dados de configuração, definindo o intervalo de tempo (por exemplo, 15 min), número de exames (por exemplo, 97) e clicando em " Load Config. " Nota: usando essas configurações, uma série de tempo de 97 x 15 min = 24 h será feita. Nome do lapso de tempo no " nome do arquivo de Base " e selecione o banco de dados (feito na etapa 3.11) clicando em " Base de dados de imagem " para salvar o lapso de tempo. Defina uma pasta temporária clicando " pasta Tmp imagem. " Nota: se o sistema para ou falha por qualquer motivo, as imagens estão localizadas nessa pasta. Abra a unidade de incubação, levantar o anel de imagens, adicionar uma gota de óleo de imersão para o objectivo e feche a unidade tão rápido quanto possível. Concentre-se e selecionar uma posição na câmara de imagens. Nota: Esta posição contém células em uma monocamada, com um mínimo de 70% de confluência, permitindo a geração de imagens de células individuais. Verifique as configurações de configuração para o plano de fundo e corrigir se necessário. Nota: O plano de fundo pode ser corrigido, reduzindo o poder de ganho ou laser. Qualquer mudança na configuração precisa ser salvo (ver passo 3.17) e carregado (consulte a etapa 3.18) novamente na macro. No fluxo laminar, diluir a droga livre ou nanopartículas em uma concentração de 5 µ g/mL fármaco ou 0,05 µmol de lipídeos em meio de cultura celular. Filtrar com um filtro de seringa 0,22 µm, se as drogas/nanopartículas não são esterilizadas. Abrir a câmara de incubação, levante a tampa de vedação, remover o meio das células, adicionar 1 mL de drogas/nanopartículas diluídas e feche a unidade tão rapidamente como possível. Concentrar-se nas células e iniciar o lapso de tempo clicando " Start Time " na macro Multi tempo X. Verificar regularmente para ver se as células ainda estão em foco ou usam o foco automático (consulte a etapa 3.16). O programa salva automaticamente o lapso de tempo no banco de dados; Não feche o banco de dados enquanto o programa estiver em execução. 4. Análise de dados dependendo da pergunta de pesquisa original, usar programas de software como ImageJ para análise de dados (consulte a seção de resultados para exemplos).

Representative Results

Etiquetando lipossomas transportadoras com diferentes marcadores tem sido descrito anteriormente9. Transportadoras rotuladas com perclorato de tetramethylindotricarbocyanine de far-red dioctadecyl (fiz; Ex = 644 nm; Em = 665 nm) ou verde 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(carboxyfluorescein) (CF-PE; Ex = 490 nm; Em = 515 nm) são apresentados neste manuscrito. Para mostrar intercelulares semelhanças e diferenças na absorção lipossomal, liberação e localização intracelular, estudaram-se diversos tipos de tumor. Estes incluem duas linhas de rato, o melanoma de B16BL611 e o carcinoma de pulmão de Lewis (LLC) e dois melanomas humanas, um altamente metastático (BLM) e um não-metastático (1F6) melanoma12,13. Todos os experimentos foram realizados utilizando células vivas. Em todos os experimentos, uma concentração de 5 µ g/mL dox, 5 µ g/mL Dox-NP ou 0,05 µmol de nanopartículas foram administrados para 3 ou 24 h. medido e analisado dox (na forma livre, liberada, encapsulada, sequestrada ou intercalada) foram referidos como DXR. Um 40x (abertura numérica: 1.3) lente objetiva de óleo foi usada, e imagem latente foi realizado com um laser de argônio 488 nm (10% / 0.2 mW de potência) e um filtro de passa-faixa 505 a 550 nm para CF-PE e marcador de depósito lisossômico (LM)-verde. Um laser de hélio-neon 543 nm (100% / 0,2 mW de potência) e um filtro passa-faixa nm de 560 para 615 foi usado para dox, Dox-NP e dos lisossomos marcador vermelho. Um laser de hélio-neon 633 nm (100% / 0,5 mW de potência) e um filtro de passa-tempo 640 nm foi usado para fez. Por causa de seu encapsulamento, a citotoxicidade em vitro , biodisponibilidade e farmacocinética da dox foram significativamente alterados3,9,14. A diferença entre a biodisponibilidade da droga quando administrada de forma livre e encapsulada é demonstrada na Figura 3. Dox é um agente intercalante e deve entrar no núcleo da célula para se tornar citotóxicos. Figura 3 e relacionados filmes 1 e 2 mostram um 3h lapso de tempo da BLM células tratadas com dox ou Dox-NP sob condições idênticas. Em poucos minutos de exposição dox, DXR nuclear pode ser observada (Figura 3A, filme 1) e, usando um menor ganho (inserção), pode ser visto intercalante no núcleo. Em contraste, quando expostos a Dox-NP, DXR intracelular é dificilmente visível dentro deste prazo (Figura 3B, filme 2). Só aumentando o ganho de fotomultiplicadores, DXR no citoplasma pode ser observada (inserir). Usando o ImageJ, analisaram-se as densidades de pixel de DXR citoplasmática e nuclear. Como as células estão em movimento durante a avaliação de lapso de tempo, é importante combinar fluorescente com imagens do brilhante-campo. Isto apresenta a possibilidade de rastreamento de células individuais e estabilizar o XY-drift usando plugins específicos no ImageJ. A análise apresentada na Figura 3, a imagem do brilhante-campo era usada para desenhar uma região de interesse (ROI) em torno do citoplasma (linha contínua) e núcleo (linha pontilhada). O gerente de ROI em ImageJ pode ser encontrado no item do menu Analyze > ferramentas > Gerenciador de ROI. Estes ROIs são usados na imagem fluorescente para analisar a densidade de pixels usando o item de menu Analyze > medida. A diferença entre a densidade de pixel no núcleo (Figura 3) e citoplasma (Figura 3D) de células dox ou Dox-NP-tratada confirma o que se vê nas imagens. Além disso, as células foram incubadas durante 24 h com dox ou Dox-NP, após o qual o composto foi substituído pelo meio e imediatamente fotografado com aumento da sensibilidade do fotomultiplicador ganho (Figura 4). Outras configurações, como o poder do laser, deslocamento, pinhole e exibição de imagens, eram idênticas. O sinal baixo DXR nas células em relação ao Tratado de dox Dox-NP-tratados é impressionante. Usando um ganho de 700, DXR nas células Dox-NP-tratada torna-se visível, Considerando que a imagem da dox já está superexposta. Este experimento simples em vitro visualiza uma diferença significativa na biodisponibilidade de livre contra drogas encapsuladas. Quando as células são continuamente expostas a Dox-NP para 24h, DXR acumula ao longo do tempo, como mostrado na Figura 5A e filmes 3 e 4. O sinal aumenta no citoplasma, e mais tarde, DXR também é encontrado nos intercalados no núcleo. Estas observações são confirmadas pelos gráficos pixel densidade (Figura 5B). A densidade de pixel citoplasmática medido é mais baixa em BLM em comparação com células 1F6 por causa da diferença na distribuição intracelular. Considerando que DXR em células 1F6 é distribuído por toda a célula, DXR em células BLM é mais concentrado em uma organela perto do núcleo (Figura 5). Portanto, a localização de drogas e transportadora em linhas de células diferentes (Figura 6) foi investigada. As células foram incubadas durante 24 h com Dox-NP/fez e imagem. Usando a imagem de campo brilhante, uma sobreposição da membrana celular (linha contínua) e núcleo (linha pontilhada) foi desenhada à imagem fluorescente de três linhas de célula diferente. Está demonstrado que a transportadora, rotulada com, segue o mesmo padrão citoplasmático como DXR aqui: concentrou-se em uma organela perto do núcleo em BLM, ao redor do núcleo inteiro na LLC e aleatoriamente espalhados por todo o citoplasma em células B16BL6. No núcleo, única DXR e n pode ser vistos, indicando lançado dox. Reduzindo o ganho do fotomultiplicador, vesículas celulares individuais, contendo DXR e transportadora, rotulados com fizeram, bem como com CF-PE (figuras 6B e 6C), podem ser vistas. Citoplasmático DXR sequestra em pequenas vesículas, e as células foram rotuladas com um marcador de depósito lisossômico viver-pilha em verde ou vermelho. A circulação desses lisossomos pode ser seguida nas células (filme 5). DXR citoplasmática e o nanocarreador colocalize dentro destas estruturas, e a diferença intercelular no padrão DXR, como visto na Figura 6, é explicada aqui. Lisossomos são aleatoriamente distribuídos por todo o citoplasma em B16BL6 e estão localizados ao lado do núcleo em células BLM (Figura 7A). Usando o ImageJ, foi calculado o colocalization entre DXR e transportadora na lisossoma (Figura 7B). As imagens de cor foram feitas binárias (processo > binário > fazer binário) e, usando o colocalization plug-in (Analyze > Colocalization), uma imagem de colocalization era feita de DXR com fez. Isso cria uma imagem colorida de verde-vermelho-branco, com pixels brancos representando os pixels colocalized de ambas as imagens. Através do menu de item processo > binário > fazer binários, os pixels brancos serão separados e convertidos em pixels pretos, do qual é medida a densidade do pixel (Analyze > medida). Posteriormente, tornou-se uma imagem colocalization entre este DXR-a imagem e a imagem binária do marcador dos lisossomos (LM) e densidade de pixel medidos. Os dados de colocalization são a porcentagem de pixels positivos para DXR-fez e marcador DXR-fez/lisossomal (Figura 7). Que o portador, rotulado com CF-PE, bem como, está localizado na lisossoma também é mostrado na Figura 7. Figura 1: configuração de equipamentos e instrumentos. A) imaging câmara + necessidades. top de 25 mm #1 tampa de vidro (1), parte inferior da câmara (2), parte da câmara (lugard de cabeça para baixo) e o-Ring (3), titular de palco (4) e tampa de vedação (5). Barra de escala: 2 cm. B) unidade de incubação. Microscópio aquecida estágio (1), fluxo com em – e out – flow para CO2 (2), uma sonda de2 CO (3) e um patch de encerramento (4). Barra de escala: 2 cm. C) Imaging câmara da unidade da incubadora, como pode ser visto sob o microscópio. D) multi-tempo série macro. E) equipamento para tratamento de imagens. Invertido microscópio (1), luz fluorescente (2), computador (3), aquecedor de anel (4, inserção) e controlador (4, figura principal), CO2 tubos de fluxo (5), CO2 válvula (6), controlador de CO2 (7), CO2 umidificador (8), O2 válvula e controlador (9) e controlador de temperatura de palco (10). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2: esquemática dos parâmetros microscópio detalhados no protocolo seção 3. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3: investigando a curto prazo absorção de dox e Dox-NP.  Células BLM foram expostas continuamente a dox ou Dox-NP por 3 h, e um lapso de tempo foi tomado. (A) ainda fotos do lapso de tempo de células incubadas com dox. (B) imagens do lapso de tempo de células incubadas com Dox-NP. Barra de escala = 50 µm. (C) Pixel densidade aumento de DXR nuclear em células dox e Dox-NP-tratados. (D) aumento de densidade de Pixel de DXR citoplasmático nas células dox e Dox-NP-tratados. Os dados representam a média ± DP de 3 células por campo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4: investigando a absorção a longo prazo de dox e Dox-NP em linhagens celulares diferentes. As células foram expostas a dox ou Dox-NP e fotografaram 24 horas mais tarde. Imagens foram tomadas imediatamente após a remoção das drogas, com 3 diferentes ganhos. Barra de escala = 50 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 5: investigando a captação celular e liberação de agentes lipossomas. As células foram expostas continuamente a Dox-NP para 24h, e tornou-se um lapso de tempo. (A) ainda fotos do lapso de tempo. Barra de escala = 50 µm. (B) Pixel densidade aumento de DXR o núcleo e o citoplasma. Os dados representam a média ± DP de 3 células por campo. (C) imagens demonstrando a localização do DXR dentro da célula. Linha sólida: membrana celular, linha pontilhada: núcleo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 6: investigando a localização de drogas e transportadora em linhagens celulares diferentes. (A) células foram expostas a Dox-NP/fez por 24 h e fotografadas. Barra de escala = 50 µm. (B) as células foram expostas a Dox-NP/fez/CF-PE para 24h e fotografadas com um ganho de intensidade baixo para distinguir vesículas individuais. (C) Bright-campo e DXR sobreposição mostrando DXR em vesículas citoplasmáticas (seta). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 7: investigação da localização intracelular de drogas e portador. As células foram expostas a Dox-NP/CF-PE/disse ou para 24h e lisossomos são visualizados usando o marcador de viver-pilha dos lisossomos (LM) em verde ou vermelho. (A) localização intracelular de DXR e a transportadora (DiD). As setas representam 3 exemplos de DXR e fizeram localizadas na lisossoma. Barra de escala = 50 µm. (B) localização co análise de DXR e a transportadora (DiD) em lisossomos (LM) usando o ImageJ. (C) percentagem de localização co de DXR e o porta-aviões em lisossomos. Os dados representam a média ± SEM 3 experiências individuais. (D) dos lisossomos sequestro da transportadora visualizado usando dois marcadores diferentes. Barra de escala = 50 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Filme 1: relacionados para Figura 3 : Células BLM foram incubadas com dox para 3h. Time-Lapse: 19 imagens, com um intervalo de 10 min. taxa de quadros: 3 fps. Barra de escala = 50 µm. por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.) Filme 2: relacionados para Figura 3 : Células BLM foram incubadas com Dox-NP para 3h. Time-Lapse: 19 imagens, com um intervalo de 10 min. taxa de quadros: 3 fps. Barra de escala = 50 µm. por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.) Filme 3: relacionados para Figura 5 : Células BLM foram incubadas com Dox-NP por 24 h. Time-Lapse: 96 imagens, com um intervalo de 15 min. taxa de quadros: fps 8. Barra de escala = 50 µm.alvo de vi”= blank” > clique aqui para ver este vídeo. (Clique para download). Filme 4: relacionados para Figura 5 : 1F6 células foram incubadas com Dox-NP durante 24 h. Time-Lapse: 96 imagens, com um intervalo de 15 min. taxa de quadros: fps 8. Barra de escala = 50 µm. por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.) Filme 5: relacionados para Figura 7 : Lisossomos de B16BL6 células estavam manchadas com um marcador de células live. Lapso de tempo: 10 imagens, com um intervalo de 10 s. taxa de quadros: 3fps. Barra de escala = 50 µm. por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)

Discussion

Como observado no passado, a fixação pode destruir lipossomal nanocarriers quase que imediatamente e DXR lançado forma estes lipossomas destruídos ainda tinham tempo para entrar no núcleo, tornando a interpretação de dados muito difícil e até mesmo enganoso. Com alguns ajustes microscópicos, o destino de quimioterápico em células vivas e tecidos pode ser investigado rotineiramente para confirmar ou derrubar observações histológicas. Um estudo recente mostrou a absorção, liberação e localização de DXR em células tratadas com dox livre e encapsulado, usando de imagem lapso de tempo de viver-pilha9. Este trabalho descreve a configuração experimental mais detalhadamente. Usando este modelo, é possível visualizar o transporte imediato de dox para o núcleo, onde se acumula continuamente até que a célula eventualmente morre. Em contraste, quando Dox-NP é usada, apenas pequenas quantidades de dox lançado são encontradas no núcleo. Embora a exposição contínua resulta em acúmulo DXR contínuo, o sinal fluorescente é muito menor em Dox-NP-contra células tratadas dox, indicando uma diferença na concentração celular e citotoxicidade subsequente. Além disso, usando marcadores de viver-pilha, foi demonstrado que, ao expor as células para Dox-NP, DXR e o nanocarreador estão localizados na lisossoma. Isso indica que o lipossoma completo é retomado pela célula e demonstra o envolvimento de uma via endocítica durante a absorção dessas nanopartículas. O DXR no núcleo é claramente de dox lançado. No entanto, usando este método, como o DXR e transportadora co localizar e parecem ser aprisionado em lisossomos, é ainda inconclusivo se isto é encapsulado ou lançado dox. É possível que a estabilidade intrínseca das nanopartículas impede liberação de dox quando localizado na lisossoma.

Neste protocolo, imagem latente da viver-pilha é demonstrada usando uma configuração microscópica específica, com um suporte de palco sob medida (as especificações podem ser dado a pedido). No entanto, mais fabrica de microscópio confocal oferece uma gama de incubadoras que executam a imagem latente da viver-pilha. Preservar as condições de cultura celular (i.e., temperatura, CO2, pH, umidade e esterilidade) é o principal critério destas incubadoras e requer alguns testes preliminares para determinar as condições apropriadas, que é explicado. Programas de aquisição de dados automatizada também podem ser entregues pela mesma fabrica. Uma opção “Multi localização” torna possível a imagem várias posições na mesma Câmara, refinando a análise estatística. No entanto, esta opção na macro mencionada neste manuscrito requer postos fixos de XYZ, pelo qual a possibilidade de corrigir para Z-drift é perdida. A Z-dimensão de digitalização pode ser incluído neste macro e usa um foco de avião para a análise. No entanto, isto requer verificação extra, aumentando a possibilidade de fototoxicidade e branqueamento.

Tal como acontece com todas as medições fluorescente, superexposição é um problema, especialmente quando se compara dois compostos com uma absorção celular diferente. A intensidade fluorescente não é somente dependente em cima do sinal intrínseco do composto, mas também em cima da taxa de absorção, a concentração e o tempo de exposição da droga. Como mostrado na Figura 3, conteúdo DXR nuclear das células tratadas dox já é visível, Considerando que nenhum sinal é visto nas células Dox-NP-tratados. Só aumentando o ganho pode o DXR em células Dox-NP-tratada ser visualizado, levando a superexposição nas células tratadas dox. Além disso, nem intracelular, Dox-NP é heterogénea, que pode resultar em inevitável sob- ou superexposição. Especialmente quando investigando o aprisionamento DXR celular, o ganho foi reduzido significativamente para distinguir organelas individuais (figuras 5B e 5C). Assim, as medições representadas pela densidade de pixel devem ser acompanhadas pelas imagens representativas para a correta interpretação dos resultados.

Fototoxicidade, branqueamento e uma baixa relação sinal-ruído são também questões importantes em microscopia fluorescente, e um compromisso entre a qualidade da imagem e a aquisição de imagem deve ser estabelecido. No entanto, mesmo quando a instalação do microscópio é o ideal, a qualidade da imagem é também largamente determinada pela qualidade das células e o composto adicionado. DXR dá um sinal forte e, com as devidas precauções, o branqueamento não foi observado, mesmo após períodos mais longos (até 72 h). No entanto, a redução do sinal fluorescente também pode ser um resultado de efluxo. Efluxo é um fenômeno importante na resistência de droga15 e ocorre quando as células a bomba a droga do site intracelular da ação. Uma diminuição do sinal fluorescente ao longo do tempo, portanto, também pode ser um resultado de dox efluxo9. Comparar o sinal fluorescente de um local não-verificado no final do experimento com a última imagem da série de lapso de tempo demonstrará branqueamento (isto é, o sinal será maior no local não-digitalizados) ou efluxo (ou seja, ambos os sinais serão idênticos). Várias opções de correção (por exemplo, plano de fundo, deriva, branqueamento, etc.) estão disponíveis em programas como o ImageJ16. Também, como a intensidade fluorescente aumenta ao longo do tempo, as definições de configuração podem ser previamente avaliadas em um experimento piloto para minimizar a exposição excessiva ao final do lapso de tempo (passo 3.21). Alternativamente, uma câmara de imagens com células já expostos à droga para o período de tempo desejado pode ser usada para inicializar as configurações. Finalmente, para este tipo de análise, concentrações de droga tóxica (etapa 3.22) devem ser evitadas e pre-estabeleceram usando bio-ensaios convencionais.

Células são continuamente cultivadas e mantidas em meio sem vermelho de fenol. Vermelho de fenol fluorescente na parte vermelha do espectro e pode ser observado em organelas celulares, provavelmente lisossomos, apresentando informações de falsos positivos (etapa 1.2). Para permitir o monitoramento de células individuais, confluência de célula não deve ultrapassar 70% (passo 3.1.). O CO2 fluxo-velocidade (passo 3.5) precisa ser regulamentada em um experimento de validação quando o equipamento foi comprado ou após manutenção. Quando a velocidade for muito elevada, médio vai evaporar. Quando a velocidade é muito baixa, vai aumentar o pH do meio, que pode afetar o crescimento de células. Como a mídia está sem as alterações de indicador de pH vermelho de fenol em pH não podem ser observadas e, portanto, são facilmente esquecidas. Uma vez que o fluxo de CO2 é validado, essas configurações podem ser usadas em todas as experiências futuras.

Usando o método descrito aqui, o destino de nanopartículas pode facilmente ser investigado usando a imagem latente da viver-pilha e microscopia de lapso de tempo. Neste procedimento, nanopartículas comercialmente disponíveis foram utilizadas. No entanto, o destino de termossensível17, lipossomas catiônicos10; lipossomas enriquecidos com shingolipids de cadeia curta,18; e nanopartículas encapsulando outras drogas8,19 também foram investigados dessa maneira em tumor e as células normais.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

As instalações de microscopia usadas são parte do centro de imagem óptico de Erasmus, e gostaríamos de agradecer a equipe do OIC para seus serviços.

Materials

DMEM (no phenol-red) Sigma D1145 Supplemented with 1 mM L-glutamine and 10 % FCS
Trypsin-versene (EDTA) Lonza BE17-161E
Fetal calf serum Sigma F7524 Heat inactivate for 30 min at 55 ºC
L-Glutamin Lonza BE17-605E
Gelatin from bovine skin Sigma G9391 Make a 0,1% solution in PBS, sterile
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma D8537
Stericup 0,22 µm filter – 500 ml  Millipore SCGPU05RE
Trypan-blue Sigma T8154
Cells: Lewis lung carcimoma ATCC CRL-1642
Cells: B16BL6 Dr. P. Brouckaert, Ghent University donated Ref.10
Cells: BLM and 1F6 Dr. van Muijen, University of Nijmegen donated Ref.11
Petri dish Greiner 664160
Doxorubicin Actavis  mentioned as dox in the manuscript
Doxil/Caelyx Janssen-Cilag mentioned as Dox-NP in the manuscript
Syringe filter 0.2 µm VWR international 10462200
Lysotracker-green DND-26 Invitrogen L7526 mentioned as lyosomal marker (LM)-green in manuscript
Lysotracker-red DND-99 Invitrogen L7528 mentioned as lyosomal marker (LM)-red in manuscript
Attofluor cell ring Invitrogen A7816
Cover glass 25 mm #1 Thermo scientific CB00250RA1
Stage holder + sealing lid Custom made
ZEISS LSM 510 microscope Zeiss
Software LSM 510 version 3.2 SP2 Zeiss
Image J NIH https://imagej.nih.gov/ij/index.html
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Referencias

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Seynhaeve, A. L., ten Hagen, T. L. Using In Vitro Live-cell Imaging to Explore Chemotherapeutics Delivered by Lipid-based Nanoparticles. J. Vis. Exp. (129), e55405, doi:10.3791/55405 (2017).
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