Détection et enrichissement des rares cellules B spécifiques de l'antigène pour l'analyse des Phénotype et fonction
Summary
Une méthode simple mais efficace qui utilise des nanoparticules magnétiques pour détecter et enrichir les cellules B antigène réactif pour l'analyse fonctionnelle et phénotypique est décrite.
Abstract
B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of <0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate and enrich these rare cells for studies of their phenotype and biology. Approaches are inevitably based on the principle that B cells recognize native antigen by virtue of cell surface receptors that are representative in specificity of antibodies that will eventually be secreted by their differentiated daughters. Perhaps the most obvious approach to the problem involves use of fluorochrome-conjugated antigens in conjunction with fluorescence-activated cell sorting (FACS). However, the utility of these methods is limited by cell frequency and the achievable rate of analysis and isolation by electronic sorting. A novel method to enrich rare antigen-specific B cells using magnetic nanoparticles that results in high yield enrichment of antigen-reactive B cells from large starting cell populations is described. This method enables improved monitoring of the phenotype and biology of antigen reactive cells before and following in vivo antigen encounter, such as after immunization or during development of autoimmunity.
Introduction
Dilution limitante analyse de la fréquence des précurseurs de cellules sécrétant des anticorps ont suggéré que les cellules B réactives à un antigène particulier se produit typiquement à une fréquence de 0,05 à 0,005% dans le répertoire normal, en fonction de l'état de vaccination et de la taille / nombre d'épitopes présents sur l'antigène. La faible fréquence de ces cellules, il a été difficile d'étudier l'évolution de leur état au cours du développement de réponses immunitaires, telles que la vaccination ou après une exposition à un antigène étranger, ou au cours du développement de l'auto-immunité. Tri 1, 2, 3, 4, 5, 6 cellules Auparavant, les chercheurs ont entrepris l' isolement des lymphocytes B de l' antigène réactif en utilisant des techniques allant de l' antigène revêtu des plaques ou des adsorbants des colonnes, à des globules rouges remise à zéro de l' antigène revêtu, à activé par fluorescence. though ces techniques ont réussi à identifier et isoler les cellules de l'antigène réactif B, les résultats ont varié en termes de rendement, la pureté et l'évolutivité. Récemment, nous avons développé une nouvelle méthode à la fois de détecter et d'enrichir rares sous-populations de lymphocytes B en utilisant des nanoparticules magnétiques. Le procédé permet l'enrichissement avec un rendement relativement élevé et la pureté des grandes populations de départ, et est compatible avec l'analyse des réponses à l'antigène. En enrichissant des populations de cellules en suspension, le procédé élimine les contraintes qui sont associées à la géométrie des plaques ou des colonnes recouvertes d'antigène, ce qui limite le débit. Enfin, étant donné que les cellules enrichies restent associées à l'antigène et d'un rapporteur fluorescent, ils peuvent être en outre purifiés par tri FACS. Comme décrit ici, nous avons utilisé cette approche pour l'étude des cellules périphériques du tétanos du sang anatoxine réactif B avant et après la vaccination des sujets humains, ainsi que les cellules de autoantigène réactif B des sujets avec différents autoitroubles mmune, y compris le diabète de type 1, la maladie de Graves, et la maladie de Hashimoto 7. Le procédé fonctionne aussi bien chez la souris et l'homme, et il est compatible avec une analyse des cellules présentatrices d'antigène réactif B à partir d'une variété de tissus (manuscrit en préparation).
Dans son format de base, les cellules mononucléaires du sang périphérique sont d'abord mises en incubation avec un antigène biotinylé avec des anticorps dirigés contre des antigènes de surface cellule requis pour l'analyse phénotypique. Cette étape de marquage est suivie par le lavage et la fixation, et l' addition de streptavidine couplée à un colorant rouge lointain fluorescent pour la détection des cellules de liaison biotinylé antigène (figure 1). Des études antérieures ont permis d' identifier des cellules B spécifiques de l' antigène d'une manière similaire , mais en utilisant directement les antigènes conjugués à un fluorochrome 8, 9, 10, 11. Bien que ce soit un digneapproche, l' utilisation d'antigènes biotinylés en conjonction avec la streptavidine permet une plus grande amplification du signal ( et donc une meilleure différenciation des cellules non contraignantes de liaison et), en particulier lorsque les antigènes sont de petite taille 12, 13, 14. Une autre considération est l'utilisation de la streptavidine à la place de l'avidine, car streptavidine est déglycosylée, ce qui diminue la liaison non spécifique. En outre, on utilise un colorant rouge lointain fluorescent comme fluorochrome en raison de sa photostabilité, le rendement quantique (luminosité) et de sa petite taille (~ 1,3 kDa). Fluorochromes de protéines tels que la phycoérythrine (~ 250 kD) et allophycocyanine (~ 105 kD) 15 ne sont pas optimales , car ils contiennent potentiellement de nombreux épitopes antigéniques. Utilisation d'un petit colorant organique fluorescent composé d'un seul épitope, tel que le colorant rouge lointain fluorescent, réduit la complexité de la population cellulaire isolée.
Une fois que les cellules sont biotinylées-antigen et adsorbé de colorant streptavidine rouge lointain fluorescent, ils sont enrichis en utilisant des nanoparticules magnétiques colorant conjugué anti-rouge lointain fluorescentes. Nanoparticules uniques ne sont pas détectés par la plupart des cytomètres de flux et donc ne doivent pas être enlevés avant la purification par FACS de tri et les essais en aval 16. sélection magnétique pour des cellules spécifiques de l'antigène B enrichit la population d'intérêt, éliminant ainsi le temps et le coût du tri des événements rares en utilisant un cytomètre de flux.
Ci-dessous, nous montrons des résultats représentatifs de l'enrichissement des cellules spécifiques anatoxine tétanique B à partir d'un sujet avant et sept jours après la vaccination de rappel antitétanique. Nous avons choisi cette application particulière , par exemple , afin de démontrer la capacité de cette méthode pour enrichir les cellules spécifiques de l' antigène B suivantes aiguë dans la stimulation in vivo. Lorsqu'il est couplé avec la cytométrie de flux, ce procédé est capable d'enrichir et de différencier naïve mémoire spécifique à un antigène, etcellules et plasmablaste B permet au chercheur de suivre l'évolution de leur fréquence au fil du temps. En outre, nous avons inclus un autre dosage en aval possible, par exemple , un essai ELISPOT, ce qui démontre que les cellules conservent l'aptitude à sécréter un anticorps suivant l' enrichissement. Une autre application de cette méthode pourrait impliquer le transfert adoptif de cellules enrichies dans un hôte. Nous avons précédemment montré les cellules conservent l'aptitude à agir en tant que cellules présentant un antigène à des lymphocytes T spécifiques de l'antigène ci-après isolement et de transfert (données non présentées). Par conséquent, il existe un certain nombre d'essais possibles en aval pouvant être couplé à la méthode qui informe ainsi la compréhension de la réponse immunitaire spécifique d'un antigène. Nous avons décrit la méthode ci-dessous, y compris les contrôles pour déterminer le rendement global, la pureté, la spécificité cellulaire, et pliez-enrichissement.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous décrivons ici un nouveau procédé pour réaliser l'isolement et l'enrichissement de cellules B de liaison d'antigène provenant du sang périphérique humain. Le procédé est facilement applicable à des souris et à d'autres tissus, tels que les ganglions lymphatiques et la rate, et est compatible avec une analyse post-enrichissement du phénotype et la fonction (manuscrit en préparation) cellulaire.
L'utilisateur doit être conscient d'un certain nombre de …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants from the JDRF (1-2008-994, 27-2012-450) and the National Institutes of Health (R01DK096492-05, R21AI124488-01, T32OD012201, and F30OD021477).
Materials
| Antigen of interest | variable | variable | At least 100 μg to biotinylate easily; if using protein try to use protein that has been validated by ELISA. It must be carrier protein free. |
| Biotin for labeling; e.g. EZ link Sulfo-NHS-LC-Biotin | e.g. Thermo Scientific | e.g. 21335 | Biotin is available in different formulations, such as those containing various length spacers, so the type used should be determined by the researcher |
| Streptavidin-Alexa Fluor 647 | Invitrogen | S21374 | Can obtain from other suppliers. |
| Anti-Cy5/Anti-Alexa Fluor 647 Microbeads | Miltenyi Biotech | 130-091-395 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| MACS manual separators | Miltenyi Biotech | variable | |
| Formaldehyde | Dilute to 2% with PBS; optional if downstream assay requires live cells | ||
| PBS without calcium and magnesium | |||
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Whole blood in heparinized collection tubes | |||
| FACS buffer (PBS + 1% BSA + 0.01% sodium azide) | |||
| Separation buffer (PBS + 0.5% BSA + 2mM EDTA) | |||
| 50 mL conical tubes | |||
| 15 mL conical tubes | |||
| 1.5 mL Eppendorf tubes | |||
| Surface marker reactive antibodies, Fc Block, live/dead discriminating stain, if needed | |||
| ELISPOT supplies, if needed |
Referencias
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