كشف وإثراء نادر محددة مستضد الخلايا B لتحليل النمط الظاهري وظيفة
Summary
ووصف وهناك طريقة بسيطة لكنها فعالة التي توظف النانوية المغناطيسية للكشف عن وإثراء خلايا B-مستضد رد الفعل لتحليل وظيفي والمظهرية.
Abstract
B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of <0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate and enrich these rare cells for studies of their phenotype and biology. Approaches are inevitably based on the principle that B cells recognize native antigen by virtue of cell surface receptors that are representative in specificity of antibodies that will eventually be secreted by their differentiated daughters. Perhaps the most obvious approach to the problem involves use of fluorochrome-conjugated antigens in conjunction with fluorescence-activated cell sorting (FACS). However, the utility of these methods is limited by cell frequency and the achievable rate of analysis and isolation by electronic sorting. A novel method to enrich rare antigen-specific B cells using magnetic nanoparticles that results in high yield enrichment of antigen-reactive B cells from large starting cell populations is described. This method enables improved monitoring of the phenotype and biology of antigen reactive cells before and following in vivo antigen encounter, such as after immunization or during development of autoimmunity.
Introduction
الحد تخفيف تحليلات تردد خلية السلائف إفراز الأجسام المضادة قد اقترح أن الخلايا B رد الفعل لمستضد معين يحدث عادة على تردد 0.05 إلى 0.005٪ في جعبته العادي، وهذا يتوقف على حالة التلقيح وحجم / عدد الحواتم موجودة على المستضد. جعلت التردد المنخفض من هذه الخلايا من الصعب دراسة التغيرات في وضعهم خلال تطوير الاستجابات المناعية، مثل بعد التطعيم أو التعرض لمستضد أجنبي، أو خلال تطوير المناعة الذاتية. سابقا، وقد الباحثون إجراء عزل خلايا B-مستضد رد الفعل باستخدام تقنيات تتراوح بين لوحات مستضد المغلفة أو الماصة العمود، لالمغلفة مستضد الدم الحمراء خلية إعادة تعيين، إلى خلية الفرز 1، 2، 3، 4، 5، 6 مضان تنشيط. بالرغم من ذلكح كانت هذه التقنيات ناجحة في تحديد وعزل الخلايا مستضد رد الفعل B، وقد اختلفت النتائج من حيث العائد والنقاء وتطويره. مؤخرا قمنا بتطوير طريقة جديدة لكلا كشف وإثراء نادرة القطعان ب اللمفاويات استخدام الجسيمات النانوية المغناطيسية. طريقة تمكن التخصيب مع ارتفاع العائد نسبيا، ونقاء من السكان انطلاق كبيرة، ومتوافق مع تحليل الردود على مستضد. من خلال إثراء من السكان من الخلايا في تعليق، والأسلوب يلغي القيود التي ترتبط مع هندسة لوحات أو الأعمدة المغلفة مستضد، والحد من الإنتاجية. وأخيرا، منذ تبقى الخلايا المخصبة المرتبطة مستضد ومراسل الفلورسنت، ويمكن زيادة تنقيته بواسطة FACS الفرز. كما هو موضح هنا استخدمنا هذا النهج لدراسة الطرفية الكزاز الدم توكسيد رد الفعل الخلايا البائية قبل وبعد التحصين من الموضوعات الإنسان، وكذلك الخلايا مستضد ذاتي رد الفعل B من الموضوعات مع مختلف autoiاضطرابات مناعية، بما في ذلك داء السكري من النوع 1، مرض جريفز، ومرض هاشيموتو 7. والطريقة تعمل ايضا على قدم المساواة في الماوس والبشرية، ومتوافق مع تحليل الخلايا مستضد رد الفعل B من مجموعة متنوعة من الأنسجة (مخطوطة قيد الإعداد).
في الشكل الأساسي لها، يتم تحضين الخلايا وحيدة النواة في الدم المحيطي لأول مرة مع مستضد المعقدة البيروكسيديز جنبا إلى جنب مع الأجسام المضادة إلى الخلية المستضدات السطحية اللازمة لتحليل المظهري. ويتبع هذه الخطوة وضع العلامات من قبل الغسيل والتثبيت، وإضافة streptavidin بالإضافة إلى صبغ بعيدة الحمراء فلوري للكشف عن الخلايا ملزمة المعقدة البيروكسيديز مستضد (الشكل 1). وقد حددت الدراسات السابقة خلايا مستضد معين B بطريقة مماثلة ولكن باستخدام مستضدات مترافق مباشرة إلى تألقي 8، 9، 10، 11. على الرغم من أن هذا هو جديرالنهج، واستخدام المضادات المعقدة البيروكسيديز بالتزامن مع streptavidin يتيح أكبر تضخيم إشارة (التمايز بالتالي أفضل من الربط والخلايا غير ملزمة)، لا سيما عندما المستضدات صغيرة 12 و 13 و 14. وهناك اعتبار آخر هو استخدام streptavidin بدلا من أفيدين لأن deglycosylated streptavidin، وخفض غير محددة وملزمة. وعلاوة على ذلك، ونحن نستخدم صبغ بعيدة الحمراء الفلورسنت كما تألقي بسبب صمود لها، والغلة الكم (السطوع)، وحجمها الصغير (~ 1.3 دينار كويتي). fluorochromes البروتين مثل فيكوإيريترين (~ 250 دينار كويتي) وallophycocyanin (~ 105 دينار كويتي) 15 ليست هي الأمثل لأنها يحتمل أن تحتوي على العديد من الحواتم مستضدي. استخدام صبغة الفلورسنت العضوية صغيرة تتألف من حاتمة واحدة، مثل صبغ بعيدة الحمراء الفلورسنت، ويقلل من تعقيد السكان خلية معزولة.
بمجرد خلايا البيروكسيديز واحدntigen وصبغ streptavidin كثف بعيدة الحمراء الفلورسنت، وإثراء أنها تستخدم لمكافحة بعيدا الحمراء الفلورسنت النانوية المغناطيسية صبغ مترافق. لم يتم الكشف عن الجسيمات النانوية واحدة من قبل معظم أجهزة قياس التدفق الخلوي، وبالتالي ليس من الضروري إزالتها قبل تنقية من قبل نظام مراقبة الأصول الميدانية الفرز والمقايسات المصب 16. اختيار المغناطيسي للخلايا مستضد معين B إثراء السكان من الاهتمام، والقضاء على الوقت والتكلفة اللازمين لفرز الأحداث النادرة باستخدام قياس التدفق الخلوي.
فيما يلي نعرض نتائج ممثلة من تخصيب الخلايا الكزاز وتوكسويد الخاصة ب من الموضوع بعد قبل وسبعة أيام التطعيم ضد التيتانوس معززة. لقد اخترنا هذا تطبيق معين على سبيل المثال من أجل إثبات قدرة هذه الطريقة لتخصيب خلايا B-مستضد معين التالية الحاد في تحفيز الجسم الحي. عندما يقترن مع التدفق الخلوي، وهذه الطريقة هي قادرة على إثراء والتمييز مستضد معين ساذجة، والذاكرة، وخلايا أرومة البلازماوية باء وتسمح للباحث لمتابعة التغيرات في وتيرتها مع مرور الوقت. وبالإضافة إلى ذلك، ندرج الممكن فحص آخر المصب، مثل مقايسة ELISPOT، والذي يدل على أن الخلايا تحتفظ القدرة على إفراز الأجسام المضادة بعد التخصيب. تطبيق آخر من هذه الطريقة يمكن أن تشمل نقل بالتبني من الخلايا المخصب إلى المضيف. لقد أظهرنا سابقا خلايا الحفاظ على القدرة على التصرف كما مستضد الخلايا إلى خلايا T مستضد معين بعد عزل ونقل (لا تظهر البيانات). وبالتالي، هناك عدد من المقايسات المصب المحتملة التي يمكن أن يقترن إلى الطريقة التي تبلغ معا فهم الاستجابة المناعية مستضد معين. وصفناها الأسلوب أدناه، بما في ذلك الضوابط لتحديد العائد الكلي، والنقاء، والنوعية الخلية، وأضعاف اليورانيوم.
Protocol
Representative Results
Discussion
نحن هنا تصف طريقة رواية لتحقيق العزلة والإثراء من خلايا B-ملزمة مستضد من الدم المحيطي البشري. طريقة قابلة للتطبيق بسهولة على الفئران والأنسجة الأخرى، مثل الطحال والغدد الليمفاوية، ومتوافق مع تحليل آخر لتخصيب النمط الظاهري خلية وظيفة (مخطوطة قيد الإعداد).
<p class="jove_co…Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants from the JDRF (1-2008-994, 27-2012-450) and the National Institutes of Health (R01DK096492-05, R21AI124488-01, T32OD012201, and F30OD021477).
Materials
| Antigen of interest | variable | variable | At least 100 μg to biotinylate easily; if using protein try to use protein that has been validated by ELISA. It must be carrier protein free. |
| Biotin for labeling; e.g. EZ link Sulfo-NHS-LC-Biotin | e.g. Thermo Scientific | e.g. 21335 | Biotin is available in different formulations, such as those containing various length spacers, so the type used should be determined by the researcher |
| Streptavidin-Alexa Fluor 647 | Invitrogen | S21374 | Can obtain from other suppliers. |
| Anti-Cy5/Anti-Alexa Fluor 647 Microbeads | Miltenyi Biotech | 130-091-395 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| MACS manual separators | Miltenyi Biotech | variable | |
| Formaldehyde | Dilute to 2% with PBS; optional if downstream assay requires live cells | ||
| PBS without calcium and magnesium | |||
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Whole blood in heparinized collection tubes | |||
| FACS buffer (PBS + 1% BSA + 0.01% sodium azide) | |||
| Separation buffer (PBS + 0.5% BSA + 2mM EDTA) | |||
| 50 mL conical tubes | |||
| 15 mL conical tubes | |||
| 1.5 mL Eppendorf tubes | |||
| Surface marker reactive antibodies, Fc Block, live/dead discriminating stain, if needed | |||
| ELISPOT supplies, if needed |
Referencias
- de Wildt, R. M., et al. A new method for the analysis and production of monoclonal antibody fragments originating from single human B cells. J Immunol Methods. 207 (1), 61-67 (1997).
- Edelman, G. M., Rutishauser, U., Millette, C. F. Cell fractionation and arrangement on fibers, beads, and surfaces. Proc Natl Acad Sci U S A. 68 (9), 2153-2157 (1971).
- Haas, W., Schrader, J. W., Szenberg, A. A new, simple method for the preparation of lymphocytes bearing specific receptors. Eur J Immunol. 4 (8), 565-570 (1974).
- Kenny, J. J., Merrill, J. E., Ashman, R. F. A two-step centrifugation procedure for the purification of sheep erythrocyte antigen-binding cells. J Immunol. 120 (4), 1233-1239 (1978).
- Snow, E. C., Vitetta, E. S., Uhr, J. W. Activation of antigen-enriched b cells. I. Purification and response to thymus-independent antigens. J Immunol. 130 (2), 607-613 (1983).
- Egeland, T., Hovdenes, A., Lea, T. Positive selection of antigen-specific B lymphocytes by means of immunomagnetic particles. Scand J Immunol. 27 (4), 439-444 (1988).
- Smith, M. J., et al. Loss of anergic B cells in prediabetic and new-onset type 1 diabetic patients. Diabetes. 64 (5), 1703-1712 (2015).
- Hulbert, C., Riseili, B., Rojas, M., Thomas, J. W. B cell specificity contributes to the outcome of diabetes in nonobese diabetic mice. J Immunol. 167 (10), 5535-5538 (2001).
- Woda, M., Mathew, A. Fluorescently labeled dengue viruses as probes to identify antigen-specific memory B cells by multiparametric flow cytometry. J Immunol Methods. 416, 167-177 (2015).
- Nair, N., et al. Optimized fluorescent labeling to identify memory B cells specific for Neisseria meningitidis serogroup B vaccine antigens ex vivo. Immun Inflamm Dis. 1 (1), 3-13 (2013).
- Amanna, I. J., Slifka, M. K. Quantitation of rare memory B cell populations by two independent and complementary approaches. Journal of immunological methods. 317 (1-2), 175-185 (2006).
- Scheid, J. F., et al. A method for identification of HIV gp140 binding memory B cells in human blood. Journal of immunological methods. 343 (2), 65-67 (2009).
- Doucett, V. P., et al. Enumeration and characterization of virus-specific B cells by multicolor flow cytometry. Journal of immunological methods. 303 (1-2), 40-52 (2005).
- Malkiel, S., et al. Checkpoints for Autoreactive B Cells in Peripheral Blood of Lupus Patients Assessed By Flow Cytometry. Arthritis Rheumatol. , (2016).
- Pape, K. A., Taylor, J. J., Maul, R. W., Gearhart, P. J., Jenkins, M. K. Different B cell populations mediate early and late memory during an endogenous immune response. Science. 331 (6021), 1203-1207 (2011).
- Abts, H., Emmerich, M., Miltenyi, S., Radbruch, A., Tesch, H. CD20 positive human B lymphocytes separated with the magnetic cell sorter (MACS) can be induced to proliferation and antibody secretion in vitro. Journal of immunological methods. 125 (1-2), 19-28 (1989).
