Gestroomlijnd eencellige TCR isolatie en generatie van retrovirale vectoren voor In Vitro es In Vivo expressie van menselijke TCRs

De T-cel receptor (TCR) dicteert T Celgedrag tijdens ontwikkeling, steady-state/homeostase en antigene stimulatie in de periferie^1,2,3. Recente uitbreiding van diepe sequencing technologieën heeft ontdekt een eerder ondergewaardeerde TCR diversiteit binnen antigeen specifieke T cel reacties. TCR diversiteit suggereert een potentieel voor functioneel brede T cel reacties. Teneinde de TCR sequentieanalyse repertoire met TCR functionele testen, moeten de sequencing-benaderingen worden ontworpen om verenigbaar met experimentele systemen en in vivo modellen gebruikt voor latere functionele analyse van select TCRs. We hebben een efficiënte aanpak voor menselijke TCR volgorde isolatie ontwikkeld en gestroomlijnd sub-kloont in een chimeer mens/muis TCR sjabloon vector compatibel met TCR expressie in HLA-gehumaniseerd muizen⁴. Isolatie van overeenkomstige Alfa en bèta ketens van heterodimeric TCRs vereist PCR versterking van beide ketens van een enkele cel. Hoewel verscheidene eencellige TCR klonen protocollen zijn ontwikkeld en gebruikt, zijn geen tot nu toe gemakkelijk compatibel met high-throughput gestroomlijnde directe klonen van onbekende Vα/Vβ TCRs in retrovirale vectoren nodig voor opnieuw uitdrukking in vivo ^4,5,6,7. Eerdere studies hebben gebruikt twee belangrijke benaderingen, hetzij om selectief versterken een beperkt gedeelte van de TCR voldoende te extrapoleren de volgorde of te versterken van de gehele TCR reeks^{4,5,6 , 7}. downstream functionele analyse van TCR sequenties verkregen via de eerste benadering vereist kostbaar in silico vergadering en DOVO bouw van de TCR. Terwijl de tweede benadering de volledige sequentie van de TCR biedt, is de menselijke constante regio niet compatibel met in vivo uitdrukking van de gekloonde TCRs in muismodellen. Onze aanpak is speciaal ontworpen om compatibel met in vivo functionele analyse van TCRs in muismodellen. We ontwikkelden een efficiënte en gestroomlijnde eencellige PCR protocol dat zorgt voor directe sub klonen van PCR fragmenten in de sjabloon expressie vector.

Onze aanpak maakt gebruik van een hooggevoelige multiplex-genest PCR-reactie die is uitgevoerd in twee stappen. In de eerste reactie van de multiplex stap een zwembad van 40 primers specifiek voor alle V-beta-ketens en een zwembad van 44 primers specifiek voor alle de V-alpha-ketens worden gebruikt voor het versterken van de TCR-alpha of TCR-beta zonder de voorkennis van de reeks (tabel 1). De voorwaartse primer heeft een adapter-reeks, die is opgenomen in de 5′ van het PCR-product. De omgekeerde primer is gebaseerd op de constante regio van de TCR. We hebben geconstateerd dat unieke beperkingsplaatsen die afwezig uit menselijke variabele of junction TCR gebieden en verwerkt deze in nieuw ontworpen TCRα en TCRβ inleidingen (Figuur 1). In de tweede geneste reactie, worden een primers specifiek voor de opeenvolging van de adapter en een geneste omgekeerde primer binnen de constante regio gebruikt voor het verder versterken van de TCR kettingen met hogere specificiteit (tabel 1, Figuur 1). Na enkele cel isolatie, twee rondes van PCR (eerste reactie met een pool van zowel Vα als Vβ inleidingen, en ten tweede met adapter inleidingen) resulteren in een PCR product dat kan worden direct sub gekloond in de sjabloon retrovirale vector. De uiteindelijke constructie van de TCR codeert, in een enkele open leesraam (ORF), menselijke variabele regio’s gecombineerd met muis constant regio’s verbonden via het ‘zelf verbrijzelen’ eiwit sequentie, P2A (hVα-mCα-P2A-hVβ-mCβ)⁸. De volgorde van P2A is gebruikt in meerdere systemen, en is uitgebreid getest speciaal voor de expressie van TCRs^8,9,10,11. Hoewel, na vertaling allermeest naar de P2A volgorde blijft gekoppeld aan de C-terminus van de alpha keten verbonden door een flexibele linker, terwijl de bèta keten signaal reeks een extra proline, deze wijziging heeft heeft geen nadelig effect op de TCR functie. De muis constant regio wordt gebruikt in de constructie in plaats van de mens om te voorkomen dat eventuele gewijzigde interacties met stroomafwaartse signalering onderdelen wanneer opnieuw uitgedrukt in muis cellen. De één ORF zal resulteren in stoichiometrische aparte expressie van Alfa en bèta ketens^9,11. Het huidige protocol is gebaseerd op de reagentia en benaderingen die wijd beschikbaar zijn, en is ontworpen om te worden uitgevoerd in een gestroomlijnde en efficiënte manier. Hoewel we specifiek deze techniek gebruikt hebben om te TCRs uit zelfontledende T cellen betrokken bij auto-immuunziekte diabetes assay, verwachten wij dat dit protocol kan zijn breed toepasbaar voor identificatie en beoordeling van de functionele van menselijke TCRs specifiek voor auto-immune epitopes, kanker epitopes of reacties op pathogenen en vaccins.