JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Divulgaciones
Acknowledgements
Materials
Referencias
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biología del desarrollo

Gedefinieerd en Scalable Generatie van hepatocyt-achtige cellen uit menselijke pluripotente stamcellen

Published: March 02, 2017
doi:
10.3791/55355
, , , , , ,
1MRC Centre for Regenerative Medicine,University of Edinburgh

Summary

De hier gepresenteerde methode beschrijft een schaalbaar en Good Manufacturing Practice (GMP) -ready differentiatie systeem om menselijke hepatocyt-achtige cellen uit pluripotente stamcellen te genereren. Het dient als een kosteneffectief en gestandaardiseerd systeem menselijke hepatocyt-achtige cellen voor fundamenteel en toegepast onderzoek humane lever genereren.

Abstract

Menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs) bezitten grote waarde voor biomedisch onderzoek. hPSCs kunnen worden geschaald en gedifferentieerde alle celtypes in het menselijk lichaam. Het verschil in hPSCs menselijke hepatocyt-achtige cellen (hlcs) is uitgebreid bestudeerd en efficiënte differentiatie protocollen zijn vastgesteld. De combinatie van extracellulaire matrix en biologische stimuli, waaronder groeifactoren, cytokines, en kleine moleculen, hebben het mogelijk gemaakt om hlcs dat primaire humane hepatocyten lijken genereren. De meeste procedures nog gebruik ongedefinieerde componenten, die tot batch-to-batch variatie. Dit dient als een belangrijke belemmering voor de toepassing van de technologie. Om dit probleem aan te pakken, hebben we een bepaald systeem voor de levercel differentiatie met behulp van menselijke recombinant laminins zoals extracellulaire matrices in combinatie met een serum-vrij differentiatie proces. Zeer efficiënte levercel specificatie werd bereikt met demonstrated verbeteringen in zowel HLC functie en fenotype. Belangrijk is dat deze is eenvoudig op te schalen via onderzoek en GMP-kwaliteit HPSC lijnen veelbelovende vooruitgang in celgebaseerde modellen en therapieën.

Introduction

Primaire humane weefsels en de afgeleide celtypen worden regelmatig gebruikt, zowel voor celgebaseerde screening en in de kliniek. Echter, wordt de toegang tot deze cellen ernstig beperkt door onvoldoende orgaandonatie en verlies van cel fenotypes na isolatie 1. hPSCs zijn een veelbelovend alternatief voor primaire weefsel en het genereren van genetische gedefinieerde en duurzame menselijke somatische cellen vergemakkelijken. Hepatocyt-achtige cellen (HLCS) afgeleid van hPSCs hebben reeds aangetoond belofte in dit gebied. Hlcs lijken op primaire humane hepatocyten in diverse aspecten, waaronder celmorfologie, hepatocyte genexpressie, metabolische functie en de gevoeligheid voor geneesmiddelen en virussen 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8. Bovendien, de onbeperkte proliferatie enzelfvernieuwingscapaciteit van zowel de onderzoeks- en GMP-grade hPSCs vergemakkelijkt de toepassing 9, 10.

Meer dan tien jaar onderzoek heeft een aantal efficiënte hepatocyt differentiatie procedures 2, 3, 5, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 gevormd. De meeste van deze systemen gebruiken ongedefinieerde componenten en / of virale transductie hepatocellulaire specificatie drijven. Om de betrouwbaarheid van de technologie op schaal te verbeteren, is het belangrijk een robuuste hepatocyt differentiatie ontwikkelensysteem dat werkelijk wordt gedefinieerd, xeno-vrij en GMP-compatibel.

Laminins (LNS) belangrijke extracellulaire matrixeiwitten die celhechting, proliferatie, migratie en differentiatie beïnvloeden. Laminins heterotrimere zijn glycoproteïnen bestaande uit een α, β één en één γ keten. Recentelijk zijn recombinant humaan laminins geproduceerd en gebruikt celbiologie. LN-511 is aangetoond dat het behoud van hPSCs 21 ondersteunen, terwijl een mengsel van LN-521 en E-cadherine maakt klonale afleiding en de uitbreiding van menselijke embryonale stamcellen 22. LN-111, anderzijds, ondersteunt het behoud van hepatoblast-achtige cellen afkomstig van hPSCs 23. Echter, voordat ons rapport, laminins 521 en 111 niet was gebruikt om HLCS met volwassen kenmerken te genereren uit hPSCs 10.

Hier hebben we detail procedures voor het kweken van hPSCs op LN-521en differentiëren ze aan beide LN-521 of een mengsel van LN-521 en LN-111 (LN-521/111-LN). We geoptimaliseerd de differentiatie protocol met behulp eencellige seeding een zeer reproduceerbare en homogene monolaag hlcs in vele formaten 14 genereren. Wij geloven dat onze gedefinieerde differentiatie systeem is een eenvoudige en kosteneffectieve methode om actieve HLCS produceren voor toepassing, wat neerkomt op een belangrijke stap voorwaarts in het veld.

Protocol

OPMERKING: Vendor informatie voor alle gebruikte reagentia in dit protocol is opgenomen in tabel 1. Alle media / platen moeten steriel en ten minste bij kamertemperatuur wanneer cellen direct contact met hen. 1. Passage menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs) op Laminin 521 OPMERKING: De cel passage hieronder beschreven is gebaseerd op enkele cellen en is ideaal voor het afleiden van een homogene populatie van hepatocyt-achtige cellen van hPSCs. Kolonie plating is ook toepasbaar en is eerder 24 beschreven. Bereid laminine beklede platen als nodig. Ontdooi de 100 ug / ml stock recombinant laminine 521 (LN-521) bij 4 ° C. Verdun de ontdooide LN-521 in ijskoude DPBS 1x (met Ca2 + / Mg2 +) een 5 ug / ml oplossing. Voeg 1 ml van 5 ug / ml LN-521 oplossing te coaten een putje van een 6-wells plaaten rock om het gelijkmatig verspreid in de put. Incubeer de platen in een 37 ° C / 5% CO 2 celkweek incubator gedurende 2-4 uur voor dringende gebruik of in een 4 ° C koelkast overnacht. Bewaar de laminine beklede platen in een 4 ° C koelkast behoefte. Houd de platen op een vlakke ondergrond en sluit ze aan verdamping en besmetting te voorkomen. LET OP: Laat de beklede putjes uitdrogen; top ze met extra 1x DPBS (met Ca 2+ / Mg 2+) indien nodig. Gebruik de platen binnen 2 weken. Laat dan het benodigde aantal vooraf beklede platen op kamertemperatuur komen vóór gebruik of Incubeer de platen bij 37 ° C gedurende 0,5-1 uur. Zorgvuldig aspireren de bekleding LN-521 oplossing zonder beschadiging van het beklede oppervlak. Opmerking: Het is belangrijk het beklede oppervlak niet beschadigt voor het zaaien cellen op. Onmiddellijk voeg 1 ml voorverwarmde mTeSR1-medium aangevuld met 10 pM Rho-geassocieerde kinase (ROCK) remmer Y27632 één putje van een 6-wells plaat. Laat de plaat in de celkweek incubator om cellen te ontvangen. LET OP: Laat nooit de-laminine beklede putjes te drogen. Zuig het medium van goed onderhouden hPSCs op ongeveer 75% tot 85% samenvloeiing. Was de cellen van het ene putje van een 6-wells plaat eenmaal met 1 ml kamertemperatuur 1x DPBS (zonder Ca 2+ / Mg 2+). Voeg 0,5 ml 1x Accutase aan de cellen en incubeer bij 37 ° C gedurende 6-8 minuten om de cellen te scheiden. LET OP: Om te controleren of de vertering lang genoeg is of niet, tik dan zachtjes de plaat en controleer of de cellen gemakkelijk los te maken. Zo ja, dan is het tijd om de enzymatische reactie te stoppen; zo niet, verlengen de digestie een extra 1-2 min. Sluit de dissociatie door toevoeging van 2 ml vers mTeSR1 medium aangevuld met 10 pM Y27632 aan de cellen. Pipet op en neer met behulp van een P1000 tip meerdere keren naar een single-cell suspensie te maken. Tel de levensvatbare cellen met een hemocytometer.Gebruik trypan Blue om vlek en sluiten dode cellen 14 Bereken het totale aantal cellen nodig. Voor routine HPSC passage, zaad 4 x 05-05 oktober x 10 5 cellen per putje van een 6-well plaat (dat wil zeggen, 4,21 x 10 4-5,26 x 10 4 per cm2). Voor passage hPSCs voor hepatocyt differentiatie, zaad 6,5 x 10 5-7,5 x 10 5 (dat wil zeggen, 6,84 x 10 4-7,89 x 10 4 per cm2) cellen per putje van een 6-wells plaat. NB: De zaaidichtheid voor elke cellijn zou kunnen hebben kleine optimalisatie nodig gebaseerd op de empirische dichtheid hier gegeven voor de lever differentiatie. Breng de benodigde celsuspensie in een steriele 15 ml of 50 ml centrifugebuis en centrifugeer bij 115 xg gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur. Zuig het supernatant langzaam en dan resuspendeer de cel pellet in verse, warme mTeSR1 medium aangevuld met 10 uM Rho-geassocieerde kinase (ROCK) inhibitor Y27632, met behulp van een adequate medium om de gewenste cel dichtheid te maken. LET OP: Het gebruik van ROCK-remmer wordt sterk aanbevolen om celhechting en de overlevingskans te vergroten. Zaad van de cellen naar de voorbereide borden en rocken ze heen en weer en links naar rechts om de cellen gelijkmatig te verdelen. NB: Het is van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat cellen gelijkmatig zijn verdeeld in de putjes of de plaat is voor routinematige celkweek of hepatocyt differentiatie experimenten. Plaats de platen in de cel incubator handhaven de cellen bij 37 ° C / 5% CO2 gedurende 24 uur zodat zij hechten en te herstellen. Onderzoek de cellen de volgende dag en ROCK inhibitor intrekken als cel-cel contact tot stand is gebracht. Handhaving van de cellen in mTeSR1 medium voor routine cultuur of over te schakelen naar differentiatie medium als dat nodig is. LET OP: Als de cellen werden gezaaid met de genoemde dichtheid, de samenvloeiing moet ideaal voor routine-onderhoud of hepatocyt differentiatio zijnn. 2. Differentiatie hPSCs tot hepatocyt-achtige cellen op Recombinant laminins Bereid differentiatie medium. Voeg humane activine A voorraadoplossing: Los humane activine A poeder een 100 ug / ml voorraadoplossing in steriele 0,2% runderserumalbumine (BSA) / DPBS maken. Maak kleine porties en bewaar ze bij -20 ° C. Gebruik 1: 1000. Maak de muis Wnt 3a voorraad: los muis Wnt 3a poeder om een ​​10 ug / ml voorraad oplossing in steriele 0,2% BSA / DPBS te maken. Maak kleine porties en bewaar ze bij -20 ° C. Gebruik bij 1: 200. Voeg menselijke hepatocyt groeifactor (HGF) voorraadoplossing: los menselijke HGF poeder een 10 gg / mL voorraadoplossing in steriele 0,2% BSA / DPBS maken. Maak kleine porties en bewaar ze bij -20 ° C. Gebruik 1: 1000. Maak Oncostatine M (OSM) voorraad: los Oncostatine M (OSM) poeder om een ​​20 ug / ml voorraad oplossing in steriele 0,2% BSA / DPBS te maken. Maak kleine porties en sscheurde ze bij -20 ° C. Gebruik 1: 1000. Voeg 500 ml endoderm-priming stock medium: 2% B27 supplement (50x, minus vitamine A) en 1% penicilline / streptomycine (eindconcentraties bij 100 IU / ml en 100 ug / ml, respectievelijk); bijvullen tot 500 ml met behulp van Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) basale medium. OPMERKING: Bewaar de voorraad bij 4 ° C en gebruik binnen twee weken. Aliquot medium uit de bouillon en voeg vers Activin A en Wnt 3a (eindconcentraties bij 100 ng / ml en 50 ng / ml, respectievelijk) bij elke medium verandering. Maak 500 ml KSR / DMSO differentiatie medium: 80% knockout DMEM (KO-DMEM), 20% knock-out serum vervanging (KSR), 0,5% GlutaMAX, 1% niet-essentiële aminozuren (NEAA), 0,1 mM beta-mercaptoethanol, 1% DMSO, en 1% penicilline / streptomycine (eindconcentraties bij 100 IU / ml en 100 ug / ml, respectievelijk). Filtreer onder vacuüm. Bewaren bij 4 ° C en binnen twee weken. Maak 500 ml HepatoZYME rijping medium: 1% GlutaMAX, 10 uM hydrocortison 21-hemisuccinaat natriumzout (HCC), en 1% penicilline / streptomycine (eindconcentraties bij 100 IU / ml en 100 ug / ml, respectievelijk); herladen tot 500 ml met behulp HepatoZYME basismedium. OPMERKING: Bewaar de voorraad bij 4 ° C en gebruik binnen twee weken. Aliquot medium uit de bouillon en voeg verse HGF en OSM (eindconcentraties bij 10 ng / ml en 20 ng / ml, respectievelijk) voor elk medium verandering. Zaad hPSCs voor hepatocyt differentiatie op LN-521, zoals beschreven in hoofdstuk 1. Wanneer LN-521 / LN-111 wordt gebruikt als het substraat, het bekleden van de platen met LN-521 en LN-111 (1: 3 verhouding) en de uiteindelijke laminine concentratie van 5 ug / ml; de andere behandeling hetzelfde als zuivere LN-521 beklede platen zijn. LET OP: LN-521 / LN-111 is niet ideaal voor routine cultuur van hPSCs; dient uitsluitend voor differentiatie experimenten. Controleer de cel confluentie 24 uur na het zaaien. Celdifferentiatie initiëren wanneer de cellen confluentie ongeveer 40% bereikt. Rchrap het doorgebracht mTeSR1 medium en voeg verse endoderm priming medium aangevuld met 100 ng / ml activine A en 50 ng / mL Wnt 3a. Noem deze differentiatie dag 1. LET OP: Het wordt sterk aangeraden om de differentiatie inleiding van de dag na het zaaien van de cellen. Verander de endoderm priming medium elke 24 uur gedurende 3 dagen voor menselijke embryonale stamcellen (hESC 's). Voor humane geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs) uitstrekken dit stadium 2 dagen om primaire cellen om definitieve endoderm-achtige cellen, maar gebruik het endoderm priming medium alleen aangevuld met 100 ng / ml activine A voor deze twee dagen 12 . LET OP: Om succesvol endoderm specificatie te waarborgen, kan men de expressie van endodermale markers, zoals FOXA2 en Sox17 onderzoeken. Volgens immunofluorescentiekleuring, meer dan 80% van de verkregen cellen positief voor beide merkers in ons laboratorium. Overschakelen naar KSR / DMSO differentiatie medium op dag 4 (voor hESCs) / dag 6 (voor hiPSCs). Verander het medium dAily voor de eerste 3 dagen en daarna op de vijfde dag van deze differentiatie podium. OPMERKING: Geen voeding nodig is op de vierde dag van deze differentiatie podium. Gebruik unsupplemented KO-DMEM aan de cellen eenmaal te wassen voor medium verandering als er veel dode cellen. Om niet te controleren of de differentiatie van deze fase succesvol is of kan men de expressie van hepatische voorlopercellen cel markers, zoals AFP, CK19 en HNF4A testen. Bijna 90% van de cellen zullen positief zijn voor deze merkers op basis van onze ervaring. Na 5 dagen van de KSR / DMSO differentiatie stadium, over te schakelen naar de HepatoZYME rijpingsfase. Was de cellen eenmaal met duidelijke HepatoZYME basaal medium na het verwijderen van de KSR / DMSO medium. Voeg HepatoZYME rijping medium aangevuld met 10 ng / ml HGF en 20 ng / ml OSM. Verander het medium elke 48 uur gedurende 7-10 dagen, waarna de cellen klaar zijn voor standaard of karakterisering verder gebruik. LET OP: Hepatocyte marker expressie onderzoeken, metabolefunctietesten (zoals cytochroom P450 activiteit), ureum en albumine-uitscheiding testen, glycogeen opslag tests en Indocyanine groen (ICG) opname tests zijn typisch analysemethoden. Opmerking: De tijdlijn van de differentiatie protocol wordt getoond in figuur 5. In ons lab, controleren we regelmatig de afgeleide HLCS 'hepatocyt-specifieke marker expressie, albumine-uitscheiding, en cytochroom P450 (CYP) 3A en 1A2 activiteit.

Representative Results

Hepatocellulaire Differentiatie van hPSCs Een menselijke embryonale stamcellen lijn, H9, en de ene mens geïnduceerde pluripotente stamcellen lijn, 33D6, werden gebruikt voor hepatocyt differentiatie. De resultaten in Figuren 1-3 zijn van H9 cellen, terwijl die in figuur 4 zijn van 33D6 cellen. Enkele cellen gezaaid op laminins gevestigde cel-cel contact na 24 uur. Nadat de cellen bedroeg ongeveer 40% confluentie werd het differentiatieproces ingeleid (figuur 1A en figuur 4A). Op laminins (zowel LN-521 en LN-521 / LN-111), deze cellen ging door opeenvolgende morfologische veranderingen en ontstond gepolariseerde hlcs (figuur 1 en figuur 4A). Hepatocyt-achtige Cell Analyse day 18 hlcs werden verzameld en onderzocht op de expressie van representatieve hepatocyt markers, HNF4A en ALB (Figuur 2A). Immunokleuring van dag 18 hlcs gebleken dat bijna 90% van de cellen tot expressie HNF4α (figuur 2B). Deze cellen gepolariseerd op laminins en vertoonden een veelhoekige uiterlijk, zoals aangegeven door E-cadherine en F-actine-expressie (Figuur 2B). Cytochroom P450 (CYP) activiteit werd beoordeeld. De CYP450 voeren een belangrijke metabolische functie van hepatocyten. Dag 18 hlcs verkregen op een gelatineus eiwitmengsel, zoals Matrigel, LN-521, en LN-521 / LN-111, werden getest op activiteit van CYP3A. Hlcs toonde significant hogere CYP3A activiteit op laminine substraten dan op Matrigel (figuur 3). Belangrijk, vergeleken met commerciële humane primaire hepatocyten (HU1339) opnieuw uitgeplaat op deze substraten hlcs hebben bijna 10 keer hogere niveausvan CYP3A activiteit 10. De differentiatie van hiPSCs was vergelijkbaar met die van hESCs. De cellen vertoonden opeenvolgende veranderingen in het uiterlijk (figuur 4A). Afgeleid hlcs geuit belangrijke hepatocyt transcriptiefactor HNF4α (figuur 4B), en bezat CYP3A activiteit en afgescheiden albumine (figuur 4C en D). Opmerkelijk hlcs afgeleid van 33D6 verkleind weergegeven CYP3A ten opzichte van H9 cellen afkomstig hlcs (figuur 3), maar het was nog steeds vergelijkbaar met humane primaire hepatocyten 10. De albumine secretie van deze hlcs was veel lager dan in primaire hepatocyten 10. Figuur 1: De Sequential morfologische veranderingen tijdens lever Differentiatie. </strong> (A) ongedifferentieerde hESC 's gezaaid als enkele cellen bereikt ongeveer 40% confluentie 24 uur na het zaaien. (B) Na priming cellen vertoonden de typische morfologie endodermale op dag 4 (C) Bij het bereiken hepatoblast-achtige fase, toonden zij een duidelijke polygonale vorm op dag 9 (D) na de rijping fase gepolariseerde hlcs waren klaar voor verdere karakterisering hier op dag 18. Schaal bar = 200 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 2: Karakterisering van HLCS. (A) Genexpressie van hepatocyt-specifieke markers, HNF4A (links) en ALB (rechts). De expressie werd geanalyseerd met behulp van dag 18 HLCS afgeleidvan hESCs zowel LN-521 en LN-521 / LN-111, en werd genormaliseerd tot het huishoudgen GAPDH en uitgedrukt in verhouding tot hESCs. De resultaten vormen de drie biologische herhalingen, en de foutbalken vertegenwoordigen standaarddeviatie (SD). * P <0,05, ** p <0,01; ongepaarde t-test. (B) Protein expressie van een belangrijke lever marker, HNF4α, en polarisatie markers, E-cadherine en F-actine. Dag 18 hlcs op LN-521-LN en 521 / LN-111 werden gekleurd voor de bovenstaande merkers en tegengekleurd met Hoechst 33342. Een negatieve controle werd uitgevoerd met de overeenkomstige immunoglobuline G (IgG). Het percentage HNF4α-positieve cellen en de SD getoond. Deze werd berekend uit vier willekeurige gezichtsvelden. Beelden werden genomen op 20X vergroting. Schaal bar = 100 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. <p class="jove_content" fo:keep-together.binnen-page = "1"> Figuur 3: Metabolic Functie Karakterisering van HLCS. Cytochroom P450 activiteit van CYP3A cellen gekweekt op Matrigel (MG), LN-521, en LN-521 / LN-111 getest. De gegevens stellen de drie biologische herhalingen, en de foutbalken vertegenwoordigen SD. ** P <0,01; one-way ANOVA met post-hoc-test Tukey's. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 4: Standard Karakterisering van HLCS. hiPSCs gekweekt op LN-521 werden onderverdeeld in HLCS. Standard karakterisering tests werden uitgevoerd op dag 17 HLCS. (A) De sequentiële morfologie van de cellen tijdens hepatische differentiatie; de tijdstippen getoond r epresent cellen op dag 1, 4, 9, en 17 (B) Immunokleuring van HNF4α expressie. Het percentage positieve cellen en de SD getoond op vier willekeurige gezichtsvelden. Beelden werden genomen op 20X vergroting. Schaal bar = 100 micrometer. (C) CYP3A activiteit op dag 17 HLCS. De gegevens stellen zes biologische herhalingen, en de fout balk vertegenwoordigt de SD. (D) albumine-uitscheiding van afgeleide HLCS meer dan 24 uur in de cultuur. De gegevens stellen vier biologische herhalingen, en de fout balk vertegenwoordigt SD. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 5: Schematische Chronologie van de differentiatie protocol.t = "_ blank"> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Om menselijke pluripotente stamcellen en translationele geneeskunde, xeno-free systemen die voldoen aan de huidige richtlijnen voor goede praktijken bij het vervaardigen zijn verplicht te bevorderen. Sleutel tot een differentiatieproces is de extracellulaire matrix (ECM). De ECM ondersteunt niet alleen celhechting, maar biedt ook toegang tot de belangrijkste signalering factoren van invloed zijn cel vastberadenheid en fenotype 25, 26.

Laminins multifunctioneel extracellulaire matrix eiwitten in vivo. In de lever, laminine secretie is cruciaal voor leverregeneratie na gedeeltelijke hepatectomie 27 en is noodzakelijk voor lever progenitor celonderhoud 28. Het belang van laminines in lever onderhoud en regeneratie was de basis voor het onderzoek in de handel verkrijgbaar recombinant humaan laminines in ons hepatocyte differentiatiesysteem.

Superior hijpatocyte differentiatie bereikt op LN-521-LN en 521/111-LN substraten vergeleken met Matrigel. Afgeleid hlcs duidelijk gepolariseerd en georganiseerd in de schaal en de celfunctie werd significant verbeterd in vergelijking met hun gelatineuze proteïnemengsel tegenhangers. Aan deze verbeteringen was de downregulatie van verontreinigende colon-, fibroblast- en stamcellen geassocieerde genen op de lamininen, evenals een afname in celproliferatie en migratie geassocieerde genexpressie 10.

Concluderend, de hier beschreven protocol genereert hepatocyt-achtige cellen die dichter in de natuur volwassen menselijke hepatocyten. De werkwijze reproduceerbaar, ontvankelijk voor automatisering, en kan kosteneffectief opgeschaald voor applicatie. Belangrijker batch-to-batch variatie aanzienlijk is verlaagd in vergelijking met technieken die Matrigel gebruiken, wat resulteert in een meer onderscheiden voor onderzoekers op dit gebied. </p>

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund met awards van de Britse Regenerative Medicine Platform (MRC MR / L022974 / 1 en MR / K026666 / 1) en een China Scholarship.

Materials

Human Recombinant Laminin 521 BioLamina LN521-02
Human Recombinant Laminin 111 BioLamina LN111-02
Recombinant mouse Wnt3a R&D Systems 1324-WN-500/CF
Human Activin A Peprotech 120-14E
Human Hepatocyte Growth Factor Peprotech 100-39
Human Oncostatin M Peprotech 300-10
Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor Y27632 Sigma-Aldrich Y0503-1MG
Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt Sigma-Aldrich H4881
DMSO Sigma-Aldrich D5879
mTeSR1 medium STEMCELL Technologies 05850
RPMI 1640 Life Technologies 21875
Knockout DMEM Life Technologies 10829
HepatoZYME Life Technologies 17705
B27 supplement Life Technologies 12587-010
Knockout Serum Replacement Life Technologies 10828
GlutaMax Life Technologies 35050
Non-essential amino acids Life Technologies 11140
2-mercaptoethanol Life Technologies 31350
Accutase Millipore SCR005
DPBS with Calcium and Magnesium ThermoFisher 14040133
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referencias

  1. Forbes, S. J., Gupta, S., Dhawan, A. Cell therapy for liver disease: From liver transplantation to cell factory. J Hepatol. 62 (1 Suppl), S157-S169 (2015).
  2. Hay, D. C., et al. Highly efficient differentiation of hESCs to functional hepatic endoderm requires ActivinA and Wnt3a signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (34), 12301-12306 (2008).
  3. Hay, D. C., et al. Direct differentiation of human embryonic stem cells to hepatocyte-like cells exhibiting functional activities. Cloning Stem Cells. 9 (1), 51-62 (2007).
  4. Medine, C. N., et al. Developing high-fidelity hepatotoxicity models from pluripotent stem cells. Stem Cells Transl Med. 2 (7), 505-509 (2013).
  5. Szkolnicka, D., et al. Accurate prediction of drug-induced liver injury using stem cell-derived populations. Stem Cells Transl Med. 3 (2), 141-148 (2014).
  6. Zhou, X., et al. Modulating innate immunity improves hepatitis C virus infection and replication in stem cell-derived hepatocytes. Stem Cell Reports. 3 (1), 204-214 (2014).
  7. Rashidi, H., Alhaque, S., Szkolnicka, D., Flint, O., Hay, D. C. Fluid shear stress modulation of hepatocyte-like cell function. Arch Toxicol. 90 (7), 1757-1761 (2016).
  8. Szkolnicka, D., et al. Reducing Hepatocyte Injury and Necrosis in Response to Paracetamol Using Noncoding RNAs. Stem Cells Transl Med. 5 (6), 764-772 (2016).
  9. Wang, Y., Hay, D. C. Mass production of stem cell derived human hepatocytes for experimental medicine. Expert Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (7), 769-771 (2016).
  10. Cameron, K., et al. Recombinant Laminins Drive the Differentiation and Self-Organization of hESC-Derived Hepatocytes. Stem Cell Reports. 5 (6), 1250-1262 (2015).
  11. Cai, J., et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional hepatic cells. Hepatology. 45 (5), 1229-1239 (2007).
  12. Sullivan, G. J., et al. Generation of functional human hepatic endoderm from human induced pluripotent stem cells. Hepatology. 51 (1), 329-335 (2010).
  13. Duan, Y., et al. Differentiation and enrichment of hepatocyte-like cells from human embryonic stem cells in vitro and in vivo. Stem Cells. 25 (12), 3058-3068 (2007).
  14. Szkolnicka, D., Farnworth, S. L., Lucendo-Villarin, B., Hay, D. C. Deriving functional hepatocytes from pluripotent stem cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 30, 1-12 (2014).
  15. Rashid, S. T., et al. Modeling inherited metabolic disorders of the liver using human induced pluripotent stem cells. J Clin Invest. 120 (9), 3127-3136 (2010).
  16. Si-Tayeb, K., et al. Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells. Hepatology. 51 (1), 297-305 (2010).
  17. Touboul, T., et al. Generation of functional hepatocytes from human embryonic stem cells under chemically defined conditions that recapitulate liver development. Hepatology. 51 (5), 1754-1765 (2010).
  18. Touboul, T., et al. Stage-specific regulation of the WNT/beta-catenin pathway enhances differentiation of hESCs into hepatocytes. J Hepatol. 64 (6), 1315-1326 (2016).
  19. Mathapati, S., et al. Small-Molecule-Directed Hepatocyte-Like Cell Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 38, 1-1 (2016).
  20. Takayama, K., et al. Efficient generation of functional hepatocytes from human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells by HNF4alpha transduction. Mol Ther. 20 (1), 127-137 (2012).
  21. Rodin, S., et al. Long-term self-renewal of human pluripotent stem cells on human recombinant laminin-511. Nat Biotechnol. 28 (6), 611-615 (2010).
  22. Rodin, S., et al. Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment. Nat Commun. 5, 3195 (2014).
  23. Takayama, K., et al. Long-term self-renewal of human ES/iPS-derived hepatoblast-like cells on human laminin 111-coated dishes. Stem Cell Reports. 1 (4), 322-335 (2013).
  24. Medine, C. N., Lucendo-Villarin, B., Zhou, W., West, C. C., Hay, D. C. Robust generation of hepatocyte-like cells from human embryonic stem cell populations. J Vis Exp. (56), e2969 (2011).
  25. Sales, V. L., et al. Transforming growth factor-beta1 modulates extracellular matrix production, proliferation, and apoptosis of endothelial progenitor cells in tissue-engineering scaffolds. Circulation. 114 (1 Suppl), I193-I199 (2006).
  26. Taylor-Weiner, H., Schwarzbauer, J. E., Engler, A. J. Defined extracellular matrix components are necessary for definitive endoderm induction. Stem Cells. 31 (10), 2084-2094 (2013).
  27. Martinez-Hernandez, A., Delgado, F. M., Amenta, P. S. The extracellular matrix in hepatic regeneration. Localization of collagen types I, III, IV, laminin, and fibronectin. Lab Invest. 64 (2), 157-166 (1991).
  28. Lorenzini, S., et al. Characterisation of a stereotypical cellular and extracellular adult liver progenitor cell niche in rodents and diseased human liver. Gut. 59 (5), 645-654 (2010).

Tags

Human Pluripotent Stem CellsHepatocyte-like CellsDefined ConditionsRecombinant Laminin MatricesDifferentiation ProtocolCell CultureScalable ProductionBiomedical ResearchCell-based ModelingCell Therapy

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artículo
Wang, Y., Alhaque, S., Cameron, K., Meseguer-Ripolles, J., Lucendo-Villarin, B., Rashidi, H., Hay, D. C. Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (121), e55355, doi:10.3791/55355 (2017).
Descargar cita
Reimpresiones y permisos

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image