Магнитная мешалка Метод обнаружения<em> трихинеллы</em> Личинки в мышечной Образцы
Summary
Предотвращение человеческого трихинеллезу во многих странах во всем мире основана на лабораторных исследований образцов мышц от восприимчивых животных методами пищеварения, из которых метод магнитная мешалка считается золотым стандартом.
Abstract
Трихинеллез является изнурительной болезни у людей и обусловлено потреблением сырой или плохо приготовленное мясо животных , зараженных личинками нематодами рода трихинелл. Наиболее важными источниками инфекции среди людей во всем мире являются мясо дичи и свинины или продуктов из свинины. Во многих странах, предотвращение человеческого трихинеллезу основан на выявлении инфицированных животных путем искусственного переваривания проб мышц от восприимчивых туш животных.
Есть несколько методов, основанных на переваривания мяса, но метод магнитной мешалкой считается золотым стандартом. Этот метод позволяет обнаружить личинок трихинелл методом микроскопии после ферментативного расщепления образцов мышц и последующих стадий фильтрации и седиментации. Хотя этот метод не требует специального и дорогостоящего оборудования, не могут быть использованы механизмы внутреннего контроля. Таким образом, строгие управления качеством должны быть applied в течение всего испытания. Целью настоящей работы является предоставление подробных инструкций по работе и критических контрольных точек метода аналитиков, основанный на опыте Справочной лаборатории Европейского союза по Паразиты и Национальной справочной лаборатории Германии для трихинелл.
Introduction
Нематод рода трихинеллы могут быть обнаружены в полосатых мышцах плотоядных и всеядным млекопитающих, птиц и рептилий по всему миру. Эти зоонозных нематоды могут достигать людей, когда сырые или полу-сырое мясо и мясные продукты, полученные из свиней, лошадей и охотничьих животных поглощаются. Это зоонозов может быть серьезное заболевание у людей , характеризующихся патогномоничных признаков и симптомов, например , диарея, лихорадка, отек периорбитальной и миалгии и возможных осложнений , таких как миокардит, тромбоэмболии и энцефалит 1.
Трихинеллы Spiralis является наиболее распространенным этиологическим агентом трихинелл инфекции у диких и домашних животных и вызывает большинство инфекций человека во всем мире. В Европе, Северной и Западной Африки и Западной Азии, трихинеллы britovi является еще одним источником инфекций человека. Кроме того, десять других таксонов реже представлены как причинного агенты заболеваний человека и обнаруживаются в различных регионах мира, как правило , у диких животных 2. В дополнение к диким животным, таким как дикий кабан, медведи, моржи и барсуков, свинина является наиболее важным источником заражения людей во всем мире.
Лучший способ предотвратить трихинеллеза является воздерживаться от употребления в пищу сырые мясные продукты и готовить любое мясо, особенно мясо дичи до безопасных температур (> 65 ° С в течение 1 мин, то есть , чтобы изменить цвет мяса от розового до коричневого в ядре мясной продукт) 3. Европейский союз и USDA были заморозки и приготовления пищи времени и температуры указаны для продуктов из свинины , которые могут быть использованы , чтобы убить личинок Spiralis T. в мясе 4, 5. Кроме того, рекомендации по инактивации трихинелл в мясе и мясных продуктах были опубликованы Международной комиссией по трихинеллеза"Xref"> 6. В Европе, в дополнение к введению регулируемых жилищных условий в коммерческих свиных стадах , где риск инфекции трихинелл незначительна, предотвращение человеческого трихинеллезу основывается на лабораторном обследовании образцов мышцы от восприимчивых животных 4.
В целях обеспечения безопасности пищевых продуктов, переваривание анализы являются единственными надежными процедуры для непосредственного обнаружения личинок трихинелл в мясе 3, 7. Даже если есть несколько вариантов анализа пищеварения, метод магнитной мешалки является международно признанным эталонный метод 3, 4, 7. Этот анализ основан на обнаружении личинок трихинелл в поперечно – полосатых мышечных тканей. После ферментативного расщепления образцов мышечных и последующих стадий фильтрации и седиментации, TriЛичинки chinella идентифицированы с помощью микроскопа. В зависимости от торговых обязательств и национального законодательства, существует множество небольших вариаций в общем протоколе метода магнитной мешалки. Здесь, технические данные основаны на требованиях ЕС 4, спецификации ISO 8, руководств по ИКТ 6, а также опыт Справочной лаборатории Европейского Союза для Паразиты (EURLP) и немецкая справочная лаборатория по трихинелл в.
Protocol
Representative Results
Discussion
Хотя метод магнитная мешалка может быть легко выполнена, строго говоря, не придерживаясь технических деталей приводит к недостаточной чувствительности, что ставит под угрозу здоровье потребителей. Критические контрольные точки были выделены в тексте выше. Кроме того, использование соответствующего оборудования имеет решающее значение для успешного результата теста. Все суда должны быть изготовлены из стекла и пипеток, покрытых силиконом, чтобы уменьшить адгезию личинок к поверхности.
Чувствительность метода сбраживания зависит от плотности личинок в мышцах и количество мышечной испытуемого образца. Для личиночной плотности 3 – 5 сжиженном мышечных тканей, сообщили чувствительность 100%, но менее 1 сжиженном чувствительность упала до 40% 13. В зависимости от исследованных видов животного-хозяина, чувствительность теста может быть повышена за счет увеличения количества используемого образца. яnfection бремя в дикой природе, как правило , низкая, поэтому более крупные образцы размеров используются 14. Склонность сайты также различаются среди животных-хозяев. Здесь, нижняя усвояемость некоторых мышечных тканей , таких как язык необходимо принимать во внимание, что также может привести к большей выборке размером 15.
Кроме того, важно понимать, что метод магнитная мешалка не включает в себя внутренний контроль. Таким образом, управление качеством обеспечение от выборки к документации имеет важное значение для получения точных и точных результатов. Качество лабораторных показателей для выявления Trichinella личинок в пробах мышц должны контролироваться посредством регулярного участия каждого аналитика в квалификационных испытаний.
Дальнейшие ограничения метода является то, что окончательная идентификация стадии личинок мышц с помощью микроскопии весьма субъективны и АЭМвилы зависит от знаний о морфологии личиночной следственным аналитика.
Интересный альтернативный способ, чтобы обойти эту проблему, является магнитный метод мешалка / на выделении фильтра с последующим обнаружением личинок с помощью теста латекс агглютинации. Тем не менее, в соответствии с законодательством ЕС этот метод только считается эквивалентом для тестирования мяса домашних свиней , но не для животных , которые подвержены повышенному риску заражения , таких как дикий кабан 4. Идентификация личиночной антигена с моноклональными антителами делает тест более объективным, но отрицает в лабораториях возможность определения количества личинок на грамм мяса 16.
Другие варианты метода магнитной мешалки включают механическими устройствами объединенного образца пищеварения метод / метод седиментации механическими устройствами объединенного образца рытьМетод estion / по технике изоляции фильтра, и автоматический метод переваривания для образцов объединенных до 35 г техники. Эти методы основаны на искусственном переваривания мяса и визуализации и подсчета личинок трихинелл, но отличаются в оборудовании , используемом для стадий фильтрации и седиментации.
Выделенный личинки могут быть дополнительно определены на уровне видов с помощью молекулярного теста (например, мультиплекс ПЦР) 17. В соответствии с законодательством ЕС, все положительные образцы должны быть направлены в национальную справочную лабораторию или EURLP для определения видов трихинелл.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы любезно благодарим Sabine Reckinger за отличную техническую помощь и поддержку.
Materials
| Knife,Scissors, Tweezers | Cutting samples and removing non-digestible tissue | ||
| Blender | With a sharp chopping blade | ||
| Magnetic stirrer | With thermostatically controlled heating plate | ||
| Stirring Rod | Teflon-coated, approximately 5 cm long | ||
| Conical glass separation funnel | Capacity of at least 2 litres, preferably fitted with Teflon safety plugs. The width should not be larger than 55% of the length to allow a good larva sedimentation | ||
| Stands, rings and clamps | |||
| Sieve | Mesh size 180 microns, external diameter 11 cm, with stainless steel mesh | ||
| Funnel | Internal diameter not less than 12 cm, to support the sieves | ||
| Glass beaker | Capacity 3 litres | ||
| Glass measuring cylinder | Capacity 50 to 100 ml, or centrifuge tube | ||
| Stereo-microscope | With a substage transmitted light source of adjustable intensity or trichinoscope with a horizontal table | ||
| Petri dishes | 9 cm diameter, marked on their undersides into 10 × 10 mm square examination areas using a pointed instrument or a larval counting basin for the tricinoscope | ||
| Aluminium foil | Alternatively a lid to cover the beakers | ||
| 25 % hydrochloric acid | |||
| Pepsin | Strength: 1:10 000 NF (US National Formulary) corresponding to 1:12 500 BP (British Pharmacopoeia) and to 2 000 FIP (Fédération internationale de pharmacie), or stabilised liquid pepsin with minimum 660 European Pharmacopoeia units/ml | ||
| Ethanol | 70-90% ethyl alcohol | ||
| Tap water | Heated to 46-48 °C before use | ||
| Balance | Accurate to at least 0.1 g | ||
| Metal tray | Capacity 10 to 15 litres, to collect the remaining digestive juice | ||
| Pipettes and pipette holder | Different sizes (1, 10 and 25 ml) | ||
| Thermometer | Accurate to 0.5 °C, temperature range at least from 20 ° C to 70 ° C | ||
| Siphon | For tap water |
Referencias
- Gottstein, B., Pozio, E., Nöckler, K. Epidemiology, Diagnosis, Treatment, and Control of Trichinellosis. Clin. Microbiol. Rev. 22, 127-145 (2009).
- Pozio, E., Murrell, D. K. Systematics and epidemiology of Trichinella. Adv. Parasitol. 63, 367-439 (2006).
- 9 CFR Part 318.10 – Prescribed treatment of pork and products containing pork to destroy trichinae. U.S. Government Publishing Office Available from: https://www.gpo.gov/fdsys/pkg/CFR-2016-title9-vol2/pdf/CFR-2016-title9-vol2-sec318-10.pdf (2012)
- Gamble, H. R., et al. International Commission on Trichinellosis: recommendations on methods for the control of Trichinella in domestic and wild animals intended for human consumption. Vet. Parasitol. 93 (3-4), 393-408 (2000).
- Gajadhar, A. A., Forbes, L. B. An internationally recognized quality assurance system for diagnostic parasitology in animal health and food safety, with example data on trichinellosis. Vet. Parasitol. 103, 133-140 (2002).
- Nöckler, K., Kapel, C. M. O. Chapter 3, Detection and surveillance for Trichinella: meat inspection and hygiene, and legislation. FAO/WHO/OIE Guidelines for the surveillance, management, prevention and control of trichinellosis. , 69-98 (2007).
- Boch, J., Schnieder, T., Supperer, R. . Veterinärmedizinische Parasitologie. , (2006).
- Despommier, D. D., Müller, M. The stichosome and its secretion granules in the mature muscle larva of Trichinella spiralis. J. Parasitol. 62 (5), 775-785 (1976).
- Marucci, G., Interisano, M., La Rosa, G., Pozio, E. Molecular identification of nematode larvae different from those of the Trichinella genus detected by muscle digestion. Vet Parasitol. 194, 117-120 (2013).
- Forbes, L. B., Gajadhar, A. A. A validated Trichinella digestion assay and an associated sampling and quality assurance system for use in testing pork and horse meat. J. Food Prot. 62, 1308-1313 (1999).
- Malakauskas, A., et al. Molecular epidemiology of Trichinella spp. in three Baltic countries: Lithuania, Latvia, and Estonia. Parasitol. Res. 100 (4), 687-693 (2007).
- Kapel, C. M., Webster, P., Gamble, H. R. Muscle distribution of sylvatic and domestic Trichinella larvae in production animals and wildlife. Vet. Parasitol. 132 (1-2), 101-105 (2005).
- Interisano, M., et al. Validation of a latex agglutination test for the detection of Trichinella infections in pigs. Vet. Parasitol. 194, 121-124 (2013).
- Pozio, E., La Rosa, ., G, PCR-derived methods for the identification of Trichinella parasites from animal and human samples. Methods Mol. Biol. 216, 299-309 (2003).
