の検出のための磁気スターラー方法<em>旋毛虫</em筋肉試料中>幼虫

1.準備 試料捕集 注：磁気攪拌方法は、単一のまたはプールされた筋肉試料のために使用することができます。 適切な好みのサイトからサンプルを収集し、適切な量の9インチ国の要件やICT、OIEやISOの勧告を参照してください。 欧州連合（EU）のために、例えば、国内の豚の筋張った部分への移行でダイアフラム柱から1グラムのサンプルを取ります。すべての筋肉サンプルは、すべての脂肪と筋膜の自由であることを確認してください。 舌がテストされている場合は、試験前に表面層を除去します。 サンプルが凍結している場合は注意してください、ほとんどの旋毛虫の幼虫として耐凍結されていないと死の後ほどく、消化に耐性が低いと減少し、アッセイ感度が得られ、容器の壁に固執する傾向があります。 注：凍結した場合は、lのサンプルサイズを倍増沈降時間を東と増加（下記参照）。 消化液の調製 3Lのガラスビーカーに48°C – 46で予熱水道水の2リットルに25％塩酸（16±0.5ミリリットル）を追加します。不完全消化の温度結果の低すぎます。温度が高すぎるペプシンの酵素特性を無効にします。 ビーカーに攪拌棒を置き、予熱したプレート上のソリューション攪拌（46から48°C）を。 （1：10,000 NF、1：12,500 BP、2000 FIP 1）酸性溶液にペプシンの10±0.2グラムを追加します。 注：ペプシンの品質が最も重要と酵素活性がプロデューサーによって認定されなければならないのです。実験室の安全上の理由及びペプシン活性を維持するために、消化液の成分を添加する順序は、に付着されなければなりません。 筋肉試料調製 ブレンダーやグラインダーで筋肉サンプルの100グラムに切り刻みます。 BLENを容易にするために鼎は、サンプルに2 mLの水を予熱追加し、2のための最大速度でブレンド – 3秒。 第二ブレンドする前に、ブレンダーを開き、下部にブレンドボウルエッジマージンの一番上にある任意の筋肉のサンプルを転送し、ブレンド繰り返します。肉の目に見える片がなくなるまで3秒 – 2のバーストとブレンド進みます。 注：あまりにも多くのブレンドは、サンプル6における旋毛虫の幼虫の存在を損傷することができますが少なすぎるとブレンドは、不完全な消化をもたらす可能性があります。 2.手順 マッスルサンプル消化 シリンダ内に消化液の1 Lを転送します。ビーカーにひき肉を移し、スプーンやフォークでの消化液に広めます。徹底的に3Lのビーカーに予熱した消化液500mLでブレンダーの蓋、ブレードとブレンダーボウルをすすぎます。 注：不完全なすすぎは、SENSの損失につながることができますitivity。 アルミホイルでビーカーを覆い、44の一定温度に保つ – 46°Cを、温度計を監視します。 肉粒子が消えるまで飛散することなく、深い渦を作成するために、30分間の消化液を攪拌します。試験された肉の種類（野生動物の肉など ）に応じて、60分の最大まで消化時間を増加させます。 濾過および消化液の沈降 未消化組織の量を決定するために、ゼロにスケールを調整し、使用前にふるいを計量し、その重量に注意してください。ふるいは、沈降漏斗に到達する旋毛虫の幼虫を妨げる可能性があり、清潔で、任意の組織粒子を欠いているでなければなりません。分離漏斗を垂直に平準化されていることを確認してください。 消化後、慎重に分離ガラス漏斗に180μmの篩を通して消化液を注ぎます。分離ガラス漏斗の幅はbはしないでください良い幼虫の沈降を可能にする長さの55％よりも電子も大きいです。任意のオーバーフローを避けるように注意してください。 感度の損失を回避するために、徹底的にスクイズ洗浄瓶から水道水の約200ミリリットルのガラスビーカーやふるいをすすぎ、沈降ガラス漏斗にすすぎ水を移します。慎重に3リットルのビーカーの縁を洗浄するために注意してください。ふるいを持ち上げて、徹底的にふるい下の面積をすすぎます。 未消化組織量の決意 注：メソッドの実行中にエラーが原因で、筋肉組織が十分に筋膜と難消化性である結合組織として、篩上に残ることができます。未消化組織の量は、最初の10分間の沈降段階（2.5参照）の間に決定されます。残留水は、未消化の組織の決定された重量に影響を与えることができるので、これは、ふるいを乾燥させるために約30分を許可します。 規模で紙タオルを置き、undigesでふるいの重量を量りますテッド組織。 未消化の組織とのふるい重量からろ過する前にふるいの重量を引きます。出発試料の重量の5％以下がふるい（ 即ち 、5 gで/ 100gで、出発物質）のままであれば、消化プロセスが十分考えられます。 未消化組織の量が5％を超える場合は、新鮮な筋肉サンプルを使用してテストを繰り返して。残りの組織は、主に未消化の筋肉組織と新鮮なサンプルで構成されている場合は利用できません、再び未消化の遺骨を消化し、元のサンプルに加えて調べます。 消化液の沈降 30分間分液漏斗中で濾過消化液を保管してください。放置した場合、 旋毛虫の幼虫は、漏斗の底に沈降します。 凍結したサンプルを使用する場合、60分の最大沈降時間を増加させます。 沈降が完了したら、完全にストップコックを開き、（筋肉サンプルは、以前に凍結していた場合は80 mL）で消化液の少なくとも40 mLの迅速測定シリンダーにオフに実行させるための分液漏斗の。 まず、シリンダ内に流体の半分をさせ、その後、完全に消化液10mLを通過できるように反対方向にコックを開きます。最後に、別の10 mLのための反対方向にコックを開きます。この手順は、 旋毛虫の幼虫は、活栓の中に閉じ込めていないことを保証します。 注：十分な速度、感度を低下させる、分液漏斗中に残っている幼虫を回避するために必要とされます。 シリンダ内の消化液の沈降 幼虫が沈降することを可能にするために10分間シリンダー内の堆積物を残します。 10 mLの堆積物を乱すことなくピペットで吸引することにより、30 mLの上清を取り除きます。 試料中の組織の繊維の量を減少させるために、沈殿物を30mLの水道水を追加し、さらに10メートル残します液体が透明になるまでに。繰り返します。 上清を除去し、10 mLのを転送するグリッドペトリ皿や幼虫計数盆地に堆積物を洗浄しました。 10mLの水道水でシリンダーを洗浄した後、サンプルに水を追加します。 注：サンプル中の破片の大量旋毛虫幼虫 （ 図1）の識別を防止することができるように必要であれば、さらなる洗浄工程が行われるべきです。 顕微鏡検査 すぐに洗浄工程後の試料を検査するために15 20Xの倍率で調節可能な強度のサブステージ送信光源とtrichinoscopeまたはステレオ顕微鏡を使用してください。 グリッドペトリ皿に試料を注いだ後、グリッドによって系統的グリッドディッシュ/盆地を調べます。何の容疑者構造が見つからない場合は、静かに任意の旋毛虫ラを可能にするために、循環方式でグリッド化ペトリ皿や幼虫計数流域内の流体を移動させます潜在的に見過ごされたrvaeは、ペトリ皿の中心に蓄積します。検査を繰り返します。 100X – 疑わしい構造が見つかった場合、40に倍率を上げます。ピペットでシャーレ/盆地から旋毛虫の幼虫を削除し、90％エタノールでチューブに集めます。 完全な皿が検討された後、シャーレ/盆地の穏やかに振盪から出発し、手順を繰り返します。少なくとも3回、またはそれ以上の幼虫までの手順を繰り返します発見されました。 幼虫の数をカウントします。筋組織の量に相関は、試験の結果、グラム（LPG）あたりの幼虫として存在します。 あまりにも多くの幼虫が確実に幼虫の数を決定するために、消化液中に存在している場合は、メスシリンダーに幼虫を含む流体を返すスクイーズ洗浄瓶から水道水ですすぎ、そして底に沈殿する幼虫を残します。 10分間の沈降時間の後、所定容量の上清を低減する（ 例えば10mL）で。正確な量を決定するために、ピペットで新しいシリンダーに上清を移します。 激しく振盪による流体に均一に幼虫を一時停止します。揺れ運動中に、ペトリ皿に20μLの幼虫の懸濁液の12滴を追加します。 顕微鏡で各液滴を調べます。 240μL中の幼虫の数を決定し、最高と最低のカウントを削除します。上清の総容量（ 例えば 10ミリリットル）に幼虫の数を推定。 注：ステレオ顕微鏡の品質は、 旋毛虫幼虫の同定のために最も重要です。 幼虫はピペットでチューブに回収された場合、幼虫はピペット壁に固執しませんでしたが、チューブに移していることを慎重に確認してください。 注：プールされたサンプルからの正旋毛虫の発見は、起源のカーカスに戻ってプールからトレースする必要があります。正の死体がアイデンなるまでここでは、プールのサイズを徐々に減少させるべきですtified。サンプルサイズはまた、感度を高めるために、このプロセスの間に増加することができます。集団サンプルの検査が陽性または不確実な結果を生成する場合には、さらに20グラムのサンプルは、各ブタから採取されます。 5匹のブタから​​20gのサンプルをプールし、記載された方法を用いて検査されます。このように5匹のブタの20グループからのサンプルを検討します。 旋毛虫は 5匹のブタからのプールされた試料中に検出されたときに、20gのサンプルは、グループ内の個々のブタから収集され、原点のプラスのカーカスが検出されるまで、それぞれを別々に検討します。