Magnetrührers Verfahren zum Nachweis von<em> Trichinella</em> Larvae in Muskelproben

1. Vorbereitungen Beispielsammlung Hinweis: Der Magnetrührer Verfahren kann für einzelne oder gepoolte Muskelproben verwendet werden. Die Proben aus den entsprechenden Prädilektionsstellen und in einer angemessenen Menge 9. Beachten Sie die länderspezifischen Anforderungen oder den Empfehlungen der IKT, der OIE oder ISO. Für die Europäische Union, zum Beispiel, nehmen Sie eine 1 g Probe aus einem Zwerchfellpfeiler am Übergang zum sehnigen Teil von Hausschweinen. Stellen Sie sicher, dass alle Muskelproben frei von Fett und Bindegewebe sind. Wenn die Zunge getestet wird, entfernen Sie die Oberflächenschicht vor dem Test. Achten Sie darauf , ob die Proben eingefroren werden, da die meisten Trichinenlarven nicht beständig einfrieren und abrollen nach dem Tod, sind weniger resistent gegen die Verdauung und neigen dazu , an den Behälterwänden zu haften, zu einer verringerten Empfindlichkeit des Assays führt. Hinweis: Wenn gefroren, verdoppeln die Stichprobengröße bei lOsten und die Sedimentation Zeit zu erhöhen (siehe unten). Vorbereitung der Verdauungsflüssigkeit In 25% HCl (16 ± 0,5 ml) auf 2 l Leitungswasser vorgewärmt bei 46 bis 48 ° C in einen 3 L Becherglas. Eine zu niedrige Temperatur führt zu einer unvollständigen Verdauung; zu hohe Temperatur deaktiviert die enzymatischen Eigenschaften von Pepsin. Legen Sie einen Rührstab in den Becher, und rühren Sie die Lösung auf eine vorgewärmte Platte (46-48 ° C). Werden 10 ± 0,2 g Pepsin (1: 10.000 NF, 1: 12.500, BP, 2.000 FIP) mit der sauren Lösung. Hinweis: Die Qualität des Pepsin ist von größter Bedeutung, und die Enzymaktivität muss vom Hersteller zertifiziert werden. Für Labor Gründen der Sicherheit und der Pepsin Aktivität zu erhalten, wobei die Reihenfolge Verdauungsflüssigkeit Komponenten der Zugabe muss eingehalten werden. Muskel – Probenvorbereitung Hacken Sie bis zu 100 g Muskelproben in einem Mixer oder Schleifer. Zur Erleichterung der blending, 2 ml für 2 Wasser zu den Proben und mischen bei max Geschwindigkeit vorgewärmt – 3 s. Vor der zweiten Mischung, öffnen Sie den Mixer geben und übertragen jede Muskelprobe an der Spitze des Mischschüssel Kantenrand auf den Boden und wiederholen Sie Blending. Weiter mit Ausbrüchen von 2 Mischen – 3 s, bis keine sichtbaren Fleischstücke bleiben. Hinweis: Eine zu geringe Vermischung in unvollständiger Verdauung führen, während zu viel Verschnitt 6 die Trichinella Larven in den Proben vorhandenen beschädigen. 2. Verfahren Muscle Probenaufschluss Übertragung 1 L des Verdauungsflüssigkeit in einen Zylinder. Übertragen Sie das Hackfleisch in den Becher und zu verbreiten, in der Verdauungsflüssigkeit mit einem Löffel oder Gabel. Spülen Sie den Mixer Deckel, Messer und Mixer Schüssel mit 500 ml des vorgewärmten Verdauungsflüssigkeit in den 3-Liter-Becher. Hinweis: Unvollständige Spülen in dem Verlust von sens führen kannitivity. Decken Sie den Becher mit Aluminiumfolie und halten eine konstante Temperatur von 44-46 ° C und Monitor mit einem Thermometer. Rühren Sie die Verdauungsflüssigkeit für 30 Minuten einen tiefen Wirbel ohne Spritzen zu schaffen, bis die Fleischpartikel verschwinden. Je nach der Art des Fleisches getestet (zB Fleisch von Wildtieren), erhöhen die Verdauungszeit bis maximal 60 min. Filtration und Sedimentation des Verdauungsflüssigkeit Um die Menge der unverdauten Gewebe bestimmen, stellen Sie die Waage auf Null, wiegen das Sieb vor dem Gebrauch, und beachten Sie dessen Gewicht. Das Sieb sollte sauber und frei von irgendwelchen Gewebepartikel sein, die die Trichinenlarven Erreichen des Sedimentationstrichter behindern könnten. Überprüfen Sie, ob die Trennung Trichter vertikal nivelliert. Nach der Verdauung, gießen Sie vorsichtig die Verdauungsflüssigkeit durch ein 180 um Sieb in einen Trichter Trennung Glas. Die Breite des Trennglastrichter sollte nicht be größer als 55% der Länge gute Larve Sedimentation zu ermöglichen. Achten Sie darauf, um ein Überlaufen zu vermeiden. Um zu vermeiden, Verlust der Empfindlichkeit, gründlich den Glasbecher und das Sieb mit etwa 200 ml Leitungswasser aus einer Spritzflasche und übertragen das Spülwasser in die Sedimentation Glastrichter. Achten Sie sorgfältig die Ränder des 3-Liter-Becher spülen. Heben Sie das Sieb und spülen Sie gründlich die Fläche unter dem Sieb. Bestimmung von unverdauten Gewebemenge Anmerkung: Aufgrund von Fehlern in der Ausführung des Verfahrens kann Muskelgewebe verbleiben auf dem Sieb als auch Faszie und Bindegewebe, die unverdaulich sind. Die Menge der unverdauten Gewebe wird während der ersten 10 min Sedimentationsschritt (siehe 2.5) bestimmt. Auf diese Weise können etwa 30 Minuten für das Sieb, um zu trocknen, als Restwasser das ermittelte Gewicht des unverdauten Gewebe beeinflussen können. Legen Sie ein Papiertuch auf einer Skala und wiegen das Sieb mit den undigested Gewebe. Ziehen Sie das Sieb Gewicht vor der Filtration aus dem Sieb Gewicht mit unverdauten Gewebe. Der Verdauungsvorgang wird als zufriedenstellend angesehen , wenn nicht mehr als 5% des Gewichts der Probe auf dem Sieb bleibt (dh 5 g / 100 g Ausgangsmaterial). Wenn die Menge an unverdauten Gewebe 5% übersteigt, wiederholen Sie den Test mit frischen Muskelproben. Wenn das verbleibende Gewebe überwiegend aus unverdauten Muskelgewebe besteht und frische Proben nicht verfügbar sind, verdauen die unverdaute Reste wieder und zusätzlich zu den Originalproben untersuchen. Sedimentation des Verdauungsflüssigkeit Halten des gefilterten Verdauungsflüssigkeit in dem Scheidetrichter während 30 min. Wenn in Ruhe gelassen, wird die Trichinenlarven am Boden des Trichters zu begleichen. Wenn gefrorene Proben verwendet werden, auf maximal 60 min die Sedimentationszeit erhöhen. Sobald Sedimentation abgeschlossen ist, öffnen Sie die Hahnmindestens 40 ml der Verdauungsflüssigkeit schnell ablaufen in einen Messzylinder (80 ml, wenn Muskelproben zuvor gefroren gewesen war) des Trenntrichter zu lassen. Zunächst wird die Hälfte der Flüssigkeit in den Zylinder lassen und dann vollständig öffnen Sie den Hahn in die entgegengesetzte Richtung 10 ml der Verdauungsflüssigkeit passieren zu lassen. Schließlich öffnen Sie den Hahn in die entgegengesetzte Richtung für weitere 10 mL. Dieses Verfahren stellt sicher , dass Trichinella – Larven werden in den Hahn nicht eingeschlossen. Hinweis: Eine ausreichende Geschwindigkeit benötigt wird, um Larven zu vermeiden, in dem Scheidetrichter verbleibende, abnehmende Empfindlichkeit. Sedimentation der Verdauungsflüssigkeit in dem Zylinder Lassen Sie das Sediment in dem Zylinder für 10 min Larven zu ermöglichen, zu sedimentieren. Entfernen Sie 30 ml Überstand mit einer Pipette Absaugen des 10 ml Sediment ohne zu stören. Um die Menge an Gewebefasern in der Probe zu reduzieren, 30 ml Leitungswasser auf dem Sediment und lassen für weitere 10 mWiederholen Sie in., Bis die Flüssigkeit klar ist. Überstand entfernen und übertragen die 10 ml Sediment zu einem gerasterten Petrischale oder Larvenzählbecken gewaschen. Spülen Sie den Zylinder mit 10 ml Leitungswasser und dann das Wasser auf die Probe hinzufügen. Hinweis: Da große Mengen von Verunreinigungen in der Probe , die die Identifizierung der Trichinenlarven verhindern kann (Abbildung 1), sollten weitere Waschschritte durchgeführt werden, falls erforderlich. Mikroskopische Untersuchung Verwenden Sie einen Trichinoskop oder ein Stereo-Mikroskop mit einer Unterstufe Durchlichtquelle mit einstellbarer Intensität bei einer 15 bis 20-facher Vergrößerung, die Proben unmittelbar nach den Waschschritten zu untersuchen. Nachdem die Probe in die gerasterten Petrischale gegossen, untersuchen Sie die Schale / Becken systematisch Raster durch Gitter. Wenn keine verdächtigen Strukturen gefunden werden, bewegen sich sanft die Flüssigkeit in der gerasterten Petrischale oder Larvenzählbecken in einer kreisförmigen Art und Weise jede Trichinella la zu ermöglichenrvae, die möglicherweise übersehen wurden, in der Mitte der Petrischale zu akkumulieren. Wiederholen Sie die Prüfung. Wenn ein Verdächtiger Struktur gefunden wird, erhöhen Vergrößerung auf 40 – 100X. Entfernen Trichinenlarven aus der Schale / Becken mit einer Pipette und sammeln sich in einem Rohr mit 90% Ethanol. Nachdem das komplette Gericht untersucht worden ist, wiederholen Sie den Vorgang, aus dem leichtem Schütteln der Schale / Becken beginnen. Wiederholen Sie das Verfahren mindestens dreimal oder bis keine Larven gefunden. Zählen Sie die Anzahl der Larven. Korrelieren auf die Menge an Muskelgewebe getestet und Gegenwart als Larven pro Gramm (LPG). Wenn zu viele Larven in der Verdauungsflüssigkeit sind die Larvenzahl zuverlässig zu bestimmen, kehren die Flüssigkeit die Larven in den Messzylinder enthält, Spülen mit Leitungswasser aus einer Spritzflasche, und lassen Larven auf den Boden absetzen. Nach 10 min Sedimentationszeit, reduzieren den Überstand zu einem definierten Volumen (zB10 ml). Um das genaue Volumen, den Überstand in ein neues Zylinder mit einer Pipette bestimmen. Suspend Larven homogen in der Flüssigkeit durch kräftiges Schütteln. Während der Schüttelbewegung, fügen Sie 12 Tropfen von 20 & mgr; l Larvensuspension auf eine Petrischale. Untersuchen Sie jeden Tropfen unter dem Mikroskop. Bestimmen Sie die Anzahl der Larven in 240 & mgr; l und löschen Sie den höchsten und den niedrigsten zählen. Extrapolieren die Anzahl der Larven auf das Gesamtvolumen (zB 10 ml) des Überstandes. Hinweis: Die Qualität des Stereomikroskop ist von größter Bedeutung für die Identifikation von Trichinella – Larven. Wenn Larven werden in ein Röhrchen mit einer Pipette gesammelt, sorgfältig zu prüfen, dass die Larven nicht an der Pipettenwand kleben haben, sind aber auf das Rohr übertragen. Hinweis: Positive Trichinella Erkenntnisse aus gepoolten Proben aus dem Pool zurückgeführt auf die Karkasse Herkunfts werden müssen. Hier sollte die Poolgröße schrittweise verringert werden, bis die positive Karkasse Iden istzierten. Die Stichprobengröße kann auch während dieses Prozesses erhöht werden Empfindlichkeit zu erhöhen. Bei der Untersuchung einer Sammelprobe ein positives oder nicht eindeutiges Ergebnis wird eine weitere 20-g-Probe von jedem Schwein entnommen. Die 20 g-Proben von fünf Schweinen werden gepoolt und untersucht die beschriebene Methode verwendet. Auf diese Weise Proben aus 20 Gruppen von fünf Schweinen untersucht. Wenn Trichinella in einer Sammelprobe von fünf Schweinen festgestellt wird, 20 g Proben werden von den einzelnen Schweine in der Gruppe gesammelt und jeweils getrennt untersucht , bis die positive Karkasse Ursprungs erkannt wird.