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Inmunología y contagio

Identification de séquences de localisation Plasmodesmal en protéines In Planta

Published: August 15, 2017
doi:
10.3791/55301
, ,
1Department of Biochemistry and Cell Biology,State University of New York, 2Department of Plant Pathology and Plant-Microbe Biology,Cornell University

Summary

Usine de connexions intercellulaires, les plasmodesmes (DP), jouent un rôle central dans l’usine des interactions plante-virus et physiologie. Critique de transport Pd sont tri signaux qui dirigent les protéines à Pd. Cependant, nos connaissances sur ces séquences est encore à ses balbutiements. Nous décrivons une stratégie visant à identifier les signaux de localisation de Pd dans les protéines ciblées Pd.

Abstract

Plasmodesmes (DP) sont des connexions de cellule-cellule qui fonctionnent comme des passerelles à travers lequel les petites et grosses molécules sont transportées entre les cellules végétales. Considérant que le transport de Pd de petites molécules, telles que des ions et l’eau, est censé se produire passivement, cellule-cellule transport des macromolécules biologiques, ces protéines, se produit probablement via un mécanisme actif qui implique des signaux spécifiques de ciblage sur les molécule transportée. La rareté des signaux de localisation des plasmodesmes identifiés (DP) (PLSs) a sévèrement restreint la compréhension du tri des protéines impliquées dans les voies des plantes transport macromoléculaire de cellule-cellule et de la communication. D’une multitude de plantes protéines endogènes et virales connues pour le trafic par le biais de Pd, PLSs seulement trois ont été signalés à ce jour, tous de protéines végétales endogènes. Ainsi, il est important d’élaborer une stratégie expérimentale fiable et systématique afin d’identifier une séquence PLS fonctionnelle, c’est-à-dire à la fois nécessaire et suffisante pour cibler les Pd, directement dans la vie cellules végétales. Nous décrivons ici une telle stratégie en utilisant comme un paradigme de la protéine de la cellule-cellule mouvement (MP) du virus de la mosaïque du tabac (TMV). Ces expériences, qui a identifié et caractérisent la première plante PLS virale, peuvent être adaptés pour la découverte de séquences PLS en protéines plus ciblées Pd.

Introduction

Plasmodesmes (DP) fonctionnent comme des conduites de transport intercellulaire des régulateurs clés du développement de la plante et morphogenèse, allant de facteurs de transcription de l’ARNm et de petites molécules d’ARN. En outre, cette capacité de transport macromoléculaire de Pd est utilisée par la plupart des virus végétaux pour leur propagation intercellulaire au cours de l’infection ; pour vous déplacer dans Pd, virus de plantes ont évolué des protéines spécialisées, appelées protéines de mouvement (MPs), visant spécifiquement les Pd1,2,3,4,5,6 , 7. les voies moléculaires du transport Pd très probablement sont intimement liés avec les séquences spécifiques qui ciblent les protéines transportées dans ces voies. Ainsi, l’identification de ces signaux de localisation de Pd (PLSs) peut être diagnostique de la voie de transport Pd correspondante. C’est par analogie des Pd transport8, par exemple, à l’importation nucléaire différentes voies, qui peuvent être spécifiques pour localisation nucléaire différents signaux (NLS) séquences9,10. D’un point de vue conceptuel, sln tant PLSs représentent non-CLIVABLES subcellulaires ciblage des séquences qui sont nécessaires et suffisantes pour le ciblage. Cependant, contrairement à la sln11, les informations de séquence sur PLSs sont fortement limitées. Plus précisément, seuls quatre séquences de protéines impliquées dans le ciblage de Pd ont été signalés, avec tous les dérivés de protéines végétales endogènes. L’un est représenté par un domaine homéotique KN112 – un facteur de transcription qui déplace des couches cellulaires internes à l’épiderme de la feuille de plante13 – et ses homologues de KNOX14. L’autre est aussi d’un facteur de transcription, Dof, qui contient un PLS putatif décrit comme le trafic intercellulaire (IT) motif15. La troisième séquence est de la protéine de la membrane PDLP1 plasmodesmes résident de type 1, et elle est représentée par un domaine transmembranaire16. Enfin, le quatrième parti démocrate ciblant la séquence a été récemment signalé pour glycosylphosphatidylinositol (GPI)-protéines ancrées et il est représenté par la glycosylphosphatidylinositol (GPI) modification signal17.

Fait intéressant, jusqu’à tout récemment, aucune PLSs n’ont été rapportés pour MPs virales. Études antérieures a révélé la présence de séquences PLS putatifs en usine virale MPs18,19, mais aucun vrai PLS, c’est-à-direune séquence minimale d’acides aminés fois nécessaire et suffisante pour le Pd ciblage d’une cargaison non apparentés molécule ( e.g., CFP) a été identifié dans un MP virale. Encore une de ces protéines, MP du virus de la mosaïque du tabac (TMV), était le premier pour lequel Pd localisation et transports ont été démontrées20.

Pour combler cette lacune, nous avons développé une stratégie expérimentale pour identifier les PLS MP TMV. Cette stratégie repose sur trois concepts. (i) nous avons défini PLS comme une séquence minimale d’acides aminés qui est nécessaire et suffisant pour cibler les protéines à Pd21. (ii) parce que le TMV MP vise tout d’abord les Pd et puis translocation à travers ces canaux22, nous nous sommes efforcés à découplage ces deux activités et à identifier la bonne foi PLS, qui fonctionne uniquement pour le ciblage de Pd et non pour le transport ultérieur. (iii) nous avons analysé les PLS identifiés pour les résidus d’acides aminés importants pour sa Pd ciblant l’activité, qu’elle soit structurellement ou fonctionnellement. En utilisant cette approche, nous avons délimité une séquence de résidus acides aminés 50 à l’extrémité aminée-TMV MP qui agit comme véritable PLS. Cela a été fait en produisant une série de fragments de TMV MP saturées toute la longueur de la protéine, marquage de leurs extrémités carboxyle avec CFP et transitoirement les exprimer dans des tissus végétaux. Localisation de PD de chacun des fragments testés a été déterminée par leur co-exprimant avec une protéine de marqueur de Pd, PDCB1 (protéine obligatoire de callose Pd 1)23. Le plus petit fragment qui toujours localisée à Pd, mais ne pas Pd, était censé représenter les PLS. Enfin, le PLS a été alanine-analysés afin de déterminer les résidus d’acides aminés essentiels nécessaires à sa structure ou de fonction.

Alors qu’ici nous illustrons cette approche en décrivant l’identification de TMV MP PLS, il peut servir à découvrir PLSs dans aucune autre protéine ciblée Pd, si codé par les agents pathogènes des plantes ou par les plantes elles-mêmes ; C’est parce que notre méthode ne tire pas parti des fonctionnalités uniques de MPs virales en ce qui concerne leur capacité à cibler à Pd.

Protocol

1. matériel végétal Choix des espèces végétales Utiliser les espèces de plantes indigènes à la protéine d’intérêt, c’est-à-dire, celui qui code cette protéine des protéines endogènes ou qui représente l’hôte naturel de l’agent pathogène pour les protéines virales. En outre, les espèces de plantes choisies doivent être favorable à la méthode choisie de transformation génétique transitoire.Remarque : Les études emploient couramment Nicotiana benthamiana…

Representative Results

Les données représentatives, qui fidèlement illustrent les résultats attendus des protocoles décrits et identifient le TMV MP PLS, constituent des adaptations de Yuan et al. 21. figure 1 a tout d’abord résume les principales constructions exprimant la pleine longueur TMV MP (1-268), MP de TMV PLS (comprenant les 50 premiers résidus d’acides aminés de la protéine, 1-50), et ses alanine numérisation V4A dérivés fusionnée à …

Discussion

Ce protocole a quatre constituants de base : le concept d’identifier une séquence qui est nécessaire et suffisant pour le ciblage de Pd, division systématique de la protéine d’intérêt en fragments qui diminuent progressivement de longueur, fusionnant la testé fragments d’une protéine auto-fluorescente qui sert comme balise et comme cargaison macromoléculaire et test fonctionnel pour Pd ciblant la vie des plantes tissus après une expression transitoire des protéines de fusion testé. Notez que l’expres…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Le manque d’espace, nous avons cité pour la plupart des articles de synthèse, et nous nous excusons à nos collègues dont le œuvre originale n’a pas cité. Le travail en laboratoire V.C. est pris en charge par des subventions du NIH, NSF, USDA/NIFA, BARD et BSF à V.C., et le laboratoire S.G.L. est pris en charge par les NIH et des fonds des départements de pathologie végétale et biologie de la plante-Microbe S.G.L.

Materials

Confocal laser scanning microscope (CLSM) Zeiss LSM5 Any CLSM with similar capabilities is appropriate
Zen software for confocal microscope imaging Zeiss 2009 version The software should be compatible with the CLSM used
Quickchange II site-directed mutagenesis kit  Agilent 200523
Acetosyringone Sigma-Aldrich D134406
MES Sigma-Aldrich 69892
Syringes without needles BD 309659
MgCl2 FisherScientific M33-500
Spectinomycin  Sigma-Aldrich S4014
Rifampicin Sigma-Aldrich R3501
Ampicillin  Sigma-Aldrich A0166
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Referencias

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PlasmodesmataLocalization SignalIntercellular TransportProtein TargetingNicotiana BenthamianaFluorescent TaggingAgrobacterium TumefaciensTransient Expression

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Yuan, C., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta. J. Vis. Exp. (126), e55301, doi:10.3791/55301 (2017).
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