ثنائي ميثيل بولي سيلوكسان البولي أجهزة ميكروفلويديك لخلية دراسات الهجرة تحت عمودي الكيميائية والتدرجات الأوكسجين
Summary
The control of chemical and oxygen gradients is essential for cell cultures. This paper reports a polydimethylsiloxane-polycarbonate (PDMS-PC) microfluidic device capable of reliably generating combinations of chemical and oxygen gradients for cell migration studies, which can be practically utilized in biological labs without sophisticated instrumentation.
Abstract
تقارير هذه الورقة جهاز ميكروفلويديك مصنوعة من ثنائي ميثيل بولي سيلوكسان (PDMS) مع البولي جزءا لا يتجزأ من (PC) رقيقة لدراسة الهجرة الخلية تحت مجموعات من التدرجات الكيميائية والأكسجين. ويمكن لكل من التدرجات الكيميائية والأكسجين تؤثر بشكل كبير الهجرة خلية في الجسم الحي. ومع ذلك، بسبب القيود التقنية، وقد تم تنفيذ القليل جدا من البحوث لتحقيق آثارها في المختبر. الجهاز المتقدمة في هذا البحث يستفيد من مجموعة من القنوات على شكل اعوج لتوليد التدرجات الكيميائية المطلوبة ويستغل طريقة التفاعل الكيميائي تقتصر مكانيا لتوليد الأوكسجين التدرج. توجيهات التدرجات الكيميائية والأكسجين هي متعامدة مع بعضها البعض لتمكين واضحة تفسير نتيجة الهجرة. من أجل توليد بكفاءة التدرجات الأوكسجين مع استهلاك المواد الكيميائية الحد الأدنى، ويستخدم جهاز الكمبيوتر رقيقة جزءا لا يتجزأ من كحاجز نشر الغاز. الجهاز ميكروفلويديك المتقدمةيمكن أن يفجرها مضخات المحاقن وضعها في حاضنة الخلية التقليدية خلال التجارب الهجرة الخلية للسماح لتبسيط الإعداد والظروف زراعة الخلايا الأمثل. في تجارب الخلايا، استخدمنا جهاز لدراسة الهجرات من خلايا adenocarcinomic الإنسان السنخية القاعدية الظهارية، A549، تحت مجموعات من chemokine (اللحمية عامل المشتقة من خلية، SDF-1α) والتدرجات الأوكسجين. وتظهر النتائج التجريبية أن الجهاز يمكن أن تولد ثابت عمودي chemokine والأكسجين التدرجات ومتوافق مع الخلايا. وتشير نتائج الدراسة الهجرة التي التدرجات الأوكسجين قد تلعب دورا أساسيا في توجيه الهجرة الخلية، والسلوك الخلوي تحت مجموعات من التدرجات لا يمكن التنبؤ بها من هم دون التدرجات واحدة. ويوفر الجهاز أداة قوية وعملية للباحثين لدراسة التفاعلات بين التدرجات الكيميائية والأكسجين في زراعة الخلايا، التي يمكن أن تعزز أفضل دراسات الهجرة خلية في أكثر في الجسم الحي تشبه microenvironments.
Introduction
التوزيع المكاني من العوامل القابلة للذوبان وتوتر الأوكسجين يمكن تنظيم عدد من الوظائف الخلوية الهامة في الجسم الحي 1، 2، 3، 4. من أجل تحقيق أفضل تأثير على الخلايا في المختبر خلية ثقافة منصة قادرة على توليد ثابت التدرجات الكيميائية والأكسجين هو المطلوب للغاية. العوامل القابلة للذوبان مختلفة تلعب دورا رئيسيا في الأنشطة البيولوجية وتؤثر على سلوك الخلوية. في الآونة الأخيرة، ويرجع ذلك إلى النهوض تقنيات الموائع الدقيقة، وقد تم وضع عدد من الأجهزة ميكروفلويديك قادرة على توليد ثابت التدرجات الكيميائية لدراسة الخلية الهجرة 5. وعلاوة على ذلك، فقد كشفت العديد من الدراسات أيضا على ضرورة توتر الأوكسجين للثقافات في المختبر خلية 6، 7، 8. ومع ذلك،السيطرة على التوتر الأكسجين لزراعة الخلايا يعتمد بشكل رئيسي على إضافة المواد الكيميائية مباشرة لالكسح الأكسجين أو خلية حاضنات مع اسطوانات الغاز المضغوط. بالإضافة الكيميائية المباشرة يغير مستنبت الخلية وتؤثر على الاستجابات الخلوية. تتطلب حاضنات مراقبة الأكسجين تصميم خاص حاضنة ودقيقة تحكم تدفق الغاز، وكمية كبيرة من غاز النيتروجين من أجل تحقيق شروط نقص الأكسجة. وعلاوة على ذلك، أصبح في حكم المستحيل للسيطرة على التوزيع المكاني للأكسجين باستخدام هذا الإعداد، الذي يؤخر دراسة سلوك الخلوية في إطار مختلف التوترات الأكسجين والتدرجات. للتغلب على هذه القيود، فقد تم وضع عدد من الأجهزة ميكروفلويديك لتوليد التدرجات الأوكسجين لتطبيقات زراعة الخلايا 9. ومع ذلك، ومعظمهم من يتم تشغيلها باستخدام الغازات المضغوطة، والتي قد تتسبب في تبخر وتوليد فقاعة المشاكل. ولذلك، فإنها غالبا ما تتطلب أجهزة متطورة وقد لا تكون موثوقة على المدى الطويل الى الدراسات زراعة الخلاياالصورة.
للتغلب على التحديات ومواصلة دراسة التفاعلات بين التدرجات الكيميائية والأكسجين للهجرة الخلايا، قمنا بتطوير جهاز ثقافة الخلية ميكروفلويديك مصنوعة من ثنائي ميثيل بولي سيلوكسان (PDMS) مع البولي جزءا لا يتجزأ من (PC) رقيقة فيلم 10. ويتكون الجهاز من طبقتين قناة ميكروفلويديك مفصولة الغشاء PDMS. الطبقة العليا هي طبقة PDMS-PC لتوليد الأوكسجين التدرج. تتكون طبقة السفلية من PDMS لتوليد التدرج الكيميائي وزراعة الخلايا. الجهاز يمكن أن تولد في وقت واحد عمودي التدرجات الكيميائية والأكسجين دون استخدام اسطوانات الغاز وأنظمة متطورة التحكم في التدفق. في الجهاز، يوفر PDMS بشفافية كبيرة البصرية، نفاذية الغاز، والتوافق البيولوجي للثقافة الخلية والتصوير. يقدم الفيلم الكمبيوتر جزءا لا يتجزأ من كحاجز نشر الغاز عن كفاءة السيطرة توتر الأوكسجين. في قناة ميكروفلويديك، كنا مجموعة من القنوات على شكل اعوجالصورة لتوليد التدرجات الكيميائية. وقد استغل تصميم على نطاق واسع لتوليد التدرجات الكيميائية في أجهزة ميكروفلويديك لمختلف التطبيقات نظرا لموثوقيتها والإعداد التجريبية سهلا. وعلاوة على ذلك، لمحات التدرج الكيميائية يمكن أن تصمم من خلال تغيير هندستها قناة مسبقا مع المحاكاة العددية. لتوليد التدرج الأوكسجين، اتخذنا الاستفادة من طريقة التفاعل الكيميائي تقتصر مكانيا التي وضعت سابقا في مختبرنا 10 و 11 و 12. الأكسجين يمكن بكسح من مناطق معينة دون تطهير النيتروجين. للاستخدام العملي في المختبرات البيولوجية، والإعداد التجريبية كامل متوافق مع حاضنات ثقافة الخلية التقليدية. من خلال دمج هذه الأساليب، ونحن يمكن أن تولد في نفس الوقت مستقرة التدرجات الكيميائية والأكسجين بدون اسطوانات الغاز بكميات كبيرة وأجهزة متطورة لدراسة الهجرة الخلية.
Protocol
Representative Results
Discussion
الخطوات الأكثر أهمية لافتعال PDMS الجهاز ميكروفلويديك مع طبقة رقيقة الكمبيوتر جزءا لا يتجزأ هي: (1) طرد جميع الفقاعات عند إدراج فيلم الكمبيوتر في PDMS قبل البوليمر في حين افتعال طبقة PDMS-PC أعلى و(2) التأكد من يتم تنفيذ جميع العمليات PDMS علاج على مستوى أفقي وجهت جيدا. للتجارب الهجرة الخلية، وأهم الخطوات هي: (1) القضاء على فقاعات داخل الجهاز ميكروفلويديك والأنابيب، ومضخات حقنة خلال التجارب، (2) التأكد من أن الجهاز ميكروفلويديك يتم وضعها على مستوى أفقي وجهت جيدا خلال تصوير الخلايا الحية لمراقبة الهجرة الخلية؛ و (3) الحفاظ على جهاز رطب بإضافة ده 2 O إلى طبق بتري خلال التجارب، والتأكد من أن المياه لا جفت.
من أجل افتعال الجهاز ميكروفلويديك PDMS-PC الهجين بنجاح دون التبطين، فمن الأهمية بمكان لإزالة جميع فقاعات أثناء فاي PCLM الإدراج. الفيلم الكمبيوتر يمكن إدراجها ببطء من زاوية (حوالي 15 إلى 30 درجة بعيدا عن PDMS سطح قبل البوليمر) لمنع توليد فقاعات خلال ادراج الفيلم الكمبيوتر في PDMS قبل البوليمر. إذا لزم الأمر، وPDMS كامل قبل البوليمر مع الفيلم الكمبيوتر جزءا لا يتجزأ من يمكن وضعها في مجفف متصلة مضخة فراغ لمدة 10 دقيقة لطرد فقاعات المحاصرين. إذا كان الفيلم الكمبيوتر يطفو تصل بعد عملية فراغ، وهي غيض ماصة يمكن استخدامها للضغط على فيلم جهاز الكمبيوتر إلى أسفل على طبقة PDMS الشفاء. تكرار عمليات الفراغ واضغط إذا لزم الأمر.
للتجارب الخليوي، وعدم وجود فقاعات الهواء أمر بالغ الأهمية للثقافة الخلية ميكروفلويديك. تأكد من أن يتم إدخال أي فقاعات الهواء إلى الإعداد ميكروفلويديك بأكمله (بما في ذلك مضخات المحاقن، وأنابيب، والجهاز ميكروفلويديك) عندما جعل الاتصالات. إذا تم إنشاء فقاعات الهواء داخل الإعداد ميكروفلويديك نتيجة لانخفاض الذوبان الغاز تحت درجة حرارة مرتفعة للبةriments داخل الحاضنة، جميع مكونات التجريبية (بما في ذلك الحقن والأنابيب) والكواشف (بما في ذلك متوسط النمو، بيروغالول، وهيدروكسيد الصوديوم) يمكن وضعها في حاضنة مسبقا (على الأقل 20 دقيقة قبل الاستخدام) لتقليل التباين في درجة الحرارة . مضخات حقنة كثيرا ما تولد الحرارة من تشغيل المحركات داخل المضخات. فمن المقبول عادة لتشغيل مضخات حقنة داخل الحاضنات. ومع ذلك، لا تحقق درجة حرارة الحاضنة خلال التجارب. إذا ترفع درجة الحرارة خلال التجارب، تحتاج إلى أن تتم إجراءات تبريد إضافية. عدة طرق التبريد مجدية يمكن استخدامها، مثل وضع مربع من الجليد في الحاضنة، والحد من عدد من مضخات المحاقن وضعت داخل الحاضنة، أو استخدام حاضنة مع نظام تبريد قوة.
الجهاز ثقافة الخلية ميكروفلويديك PDMS-PC وضعت في هذه الورقة هو قادر على توليد موثوق عمودي التدرجات الكيميائية والأكسجين FOص دراسات الهجرة الخلية. الحد من الجهاز المتقدمة هو أن ملامح الأكسجين التدرج الناتجة تعتمد على التوازن بين تدفق الأكسجين، مدفوعا الكسح تفاعل كيميائي، وانتشار الأوكسجين من الغلاف الجوي المحيط، من خلال الجهاز، وفي المتوسط. ونتيجة لذلك، لمحات الأكسجين التدرج لا يمكن السيطرة عليها بشكل تعسفي داخل الجهاز. بالمقارنة مع منصات ثقافة الخلية ميكروفلويديك القائمة، وجهاز وضعت في هذه الورقة هو أول واحد قادر على إجراء دراسات ثقافة الخلية تحت مجموعات من التدرجات الكيميائية والأكسجين. يمكن أن تكون ملفقة الجهاز بأكمله باستخدام الناعمة عملية صب الطباعة الحجرية نسخة التقليدية، دون محاذاة شاقة والأجهزة باهظة الثمن. التدرجات يمكن محاكاة عدديا وتتميز تجريبيا لتوفير ظروف تشبه المكروية أكثر الفسيولوجية لفي الدراسات المختبرية الخلية. باستخدام تقتصر مكانيا طريقة تفاعل كيميائي مع فيلم PC باعتباره دي الغازحاجز ffusion، يمكن أن تتولد التدرج الأوكسجين دون استخدام اسطوانات الغاز المضغوط السيطرة على وحدات تدفق الغاز المتطورة. وبالإضافة إلى ذلك، والإعداد يتطلب كميات صغيرة فقط من المواد الكيميائية (أقل من 10 مل لكل يوم) للحفاظ على التدرجات الأوكسجين. منذ يقتصر على مراقبة توتر الأوكسجين محليا حول قناة ميكروفلويديك، ولن يؤثر على تركيز الأكسجين المحيطة، والإعداد كله يمكن وضعها داخل حاضنة زراعة الخلايا التقليدية، دون مزيد من الحرارة والرطوبة وثاني أكسيد الكربون 2 أجهزة التحكم. ونتيجة لذلك، فإن الجهاز المتقدمة لديها امكانات كبيرة لاستخدامها عمليا في مختبرات بيولوجية.
بسبب القيود التقنية، ونادرا ما تمت دراسة السلوكيات الخلوية تحت التوتر الأكسجين في الأدبيات الموجودة. مع مساعدة من الجهاز وضعت في هذه الورقة، وزراعة الخلايا تحت التدرجات الأوكسجين لا يمكن أن يؤديها بطريقة سطحية أن يعزز إلى حد كبير دراسات الخلايا تحت التدرجات الأوكسجين. Furthermore، يمكن تطبيق مبدأ عملية مشابهة لتوليد التدرجات الغازية ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية الأخرى، مثل ثاني أكسيد الكربون وأكسيد النيتريك، للثقافة في المختبر خلية دراسات 17. وتظهر هذه القدرات أن PDMS-PC جهاز ميكروفلويديك يظهر إمكانات كبيرة لمختلف التطبيقات زراعة الخلايا، بما في ذلك اختبار المخدرات وتكاثر الخلايا والمقايسات الهجرة، للمضي قدما في دراسات زراعة الخلايا في المختبر.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This paper is based on work supported by the National Health Research Institutes (NHRI) in Taiwan under the Innovative Research Grant (IRG) (EX105-10523EI), the Taiwan Ministry of Science and Technology (MOST 103-2221-E-001-001-MY2, 104-2221-E-001-015-MY3, 105-2221-E-001-002-MY2), the Academia Sinica Thematic Project (AS-105-TP-A06), and the Research Program in Nanoscience and Nanotechnology. The authors would like to thank Ms. Rachel A. Lucas for proofreading the manuscript.
Materials
| 1 ml Syringe | Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 302104 | |
| 1.5 ml Microcentrifuge Tube | Smartgene | 6011-000 | |
| 10 ml Syringe | Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 302151 | |
| 15 ml Centrifuge Tube | ThermoFisher Scientific,Waltham, MA | Falcon 352096 | |
| 150 mm Petri-Dish | Dogger Science | DP-43151 | |
| 1H,1H,2H,2H-Perfluorooctyltrichlorosilane | Alfa Aesar, Ward Hill, MA | 78560-45-9 | |
| 3 ml Syringe | Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 302118 | |
| 4'' Silicon Dummy Wafer | Wollemi Technical, Taoyuan, Taiwan | ||
| Acetone | ECHO Chemical, Miaoli, Taiwan | AH3102-000000-72EC | |
| AG Double Expose Mask Aligner | M&R Nano Technology, Taoyuan, Taiwan | AG500-4D-D-V-S-H | |
| Antibiotic-Antimyotic solution | ThermoFisher Scientific,Waltham, MA | GIBCO 15240-062 | |
| Biopsy punch | Miltex, Plainsboro, NJ | 33-31 | |
| Blunt needle | JensenGlobal, Santa Barbara, CA | Gauge 14 | |
| Bright-Line Hemocytometer | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | Z359629 | for cell counting |
| Buffered Oxide Etch | ECHO Chemical, Miaoli, Taiwan | PH3101-000000-72EC | |
| Cell Culture Incubator | Caron, Marietta, OH | 6016-1 | |
| COMSOL Multiphysics | COMSOL, Burlington, MA | Ver. 4.3b | for numerical simulation of chemical gradients in the device |
| D-PBS | ThermoFisher Scientific,Waltham, MA | GIBCO 14190-144 | |
| Desicattor | A-VAC Industries, Anaheim, CA | 35.10001.01 | |
| DMEM/ F12+GlutaMax-1 | ThermoFisher Scientific,Waltham, MA | GIBCO 10565-018 | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher Scientific,Waltham, MA | GIBCO 10082 | |
| Fibronectin from Human Plasma | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | F2006 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | DMIL LED | |
| Isopropyl Alcohol (IPA) | ECHO Chemical, Miaoli, Taiwan | CMOS112-00000-72EC | |
| JuLi Smart Fluorescence Cell Imager | NanoEnTek, Seoul, Korea | DBJ01B | |
| Mechanical Convention Oven | ThermoFisher Scientific,Waltham, MA | Lindberg Blue M MO1450C | |
| NaOH | Showa Chemical Industry, Tokyo, Japan | 1943-0150 | |
| Plasma tretment system | Nordson MARCH, Concord CA | PX-250 | for oxygen plasma surface treatment |
| Polycarbonate (PC) film | Quantum Beam Technologies, Tainan Taiwan | ||
| Polydimehtylsiloxane (PDMS) | Dow Corning, Midland, MI | SYLGARD 184 | |
| Pyrogallol | Alfa Aesar, Ward Hill, MA | A13405 | |
| Removable Adhesive Putty | 3M | 860 | |
| Sorvall Legend Mach 1.6R Tabletop Centrifuge | ThermoFisher Scientific,Waltham, MA | ||
| Spin Coater | ELS Technology, Hsinchu, Taiwan | ELS 306MA | |
| SU-8 2050 | MicroChem, Westborough, MA | SU-8 2050 | |
| SU-8 Developer | MicroChem, Westborough, MA | Y020100 | |
| Surgical blade | Feather, Osaka, Japan | 5005093 | for PDMS cutting |
| Syringe Pump | Chemyx, Houston, TX | Fusion 400 | |
| T75 Cell Culture Flask | ThermoFisher Scientific,Waltham, MA | Nunc 156367 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | ThermoFisher Scientific,Waltham, MA | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA | ThermoFisher Scientific,Waltham, MA | GIBCO 25200 | |
| Tygon PTFE Tubing | Saint-Gobain Performance Plastics, Akron, OH | ||
| Tygon Tubing | Saint-Gobain Performance Plastics, Akron, OH | 621 |
Referencias
- Phillips, J. E., Burns, K. L., Le Doux, J. M., Guldberg, R. E., García, A. J. Engineering graded tissue interfaces. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105 (34), 12170-12175 (2008).
- Wang, F. The signaling mechanisms underlying polarity and chemotaxis. Cold Spring Harb. Perspect Biol. 1 (4), 1-16 (2009).
- Oh, S. H., Ward, C. L., Atala, A., Yoo, J. J., Harrison, B. S. Oxygen generating scaffolds for enhancing engineering tissue survival. Biomaterials. 30 (5), 757-762 (2009).
- Decaris, M. L., Lee, C. I., Yoder, M. C., Tarantal, A. F., Leach, J. K. Influence of the oxygen microenvironment on the proangiogenic potential of human endothelial colony forming cells. Angiogenesis. 12, 303-311 (2009).
- Chung, B. G., et al. Human neural stem cell growth and differentiation in a gradient-generating microfluidic device. Lab Chip. 5 (4), 401-406 (2005).
- Harris, A. L. Hypoxia – a key regulatory factor in tumor growth. Nat. Rev. Cancer. 2 (1), 38-47 (2002).
- Allen, J. W., Bhatia, S. N. Formation of steady-state oxygen gradients in vitro: application to liver zonation. Biotechnol. Bioeng. 82 (3), 253-262 (2003).
- McCord, A. M., Jamal, M., Shankavaram, U. T., Lang, F. F., Camphausen, K., Tofilon, P. J. Physiologic oxygen concentration enhances the stem-like properties of CD133+ human glioblastoma cells in vitro. Mol. Cancer Res. 7 (4), 489-497 (2009).
- Lo, J. F., Sinkala, E., Eddington, D. T. Oxygen gradients for open well cellular cultures via microfluidic substrates. Lab Chip. 10 (18), 2394-2401 (2010).
- Chang, C. W., et al. A polydimethylsiloxane-polycarbonate hybrid microfluidic device capable of generating perpendicular chemical and oxygen gradients for cell culture studies. Lab Chip. 14 (19), 3762-3772 (2014).
- Chen, Y. A., et al. Generation of oxygen gradients in microfluidic devices for cell culture using spatially confined chemical reactions. Lab Chip. 11 (21), 3626-3633 (2011).
- Peng, C. C., Liao, W. H., Chen, Y. H., Wu, C. Y., Tung, Y. C. A microfluidic cell culture array with various oxygen tensions. Lab Chip. 13 (16), 3239-3245 (2013).
- Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft Lithography. Ann. Rev. Mate. Sci. 28, 153-184 (1998).
- Friend, J., Yeo, L. Fabrication of microfluidic devices using polydimethylsiloxane. Biomicrofluidics. 4 (2), 026502 (2010).
- Cordelières, F. P. . Manual Tracking. , (2005).
- Asano, Y., Horn, E. . Instructions Chemotaxis and Migration Tool 2.0. , (2013).
- Chen, Y. H., Peng, C. C., Cheng, Y. J., Wu, J. G., Tung, Y. C. Generation of nitric oxide gradients in microfluidic devices for cell culture using spatially controlled chemical reactions. Biomicrofluidics. 7 (6), 064104 (2013).
