El aislamiento y enriquecimiento de hígado progenitoras subconjuntos identificados por una combinación de marcadores de superficie Novel
Summary
lesiones hepáticas están acompañados por la expansión de células progenitoras que representa una población heterogénea de células. clasificación Novel de este compartimento celular permite la distinción de varios subconjuntos. El método descrito aquí ilustra el flujo de análisis de citometría de alto aislamiento y pureza de varios subconjuntos que se pueden utilizar para más ensayos.
Abstract
Durante lesiones crónicas del hígado, las células progenitoras se expanden en un proceso denominado reacción ductular, que también implica la aparición de infiltrado celular inflamatorio y la activación de las células epiteliales. La población de células progenitoras durante tales reacciones inflamatorias principalmente se ha investigado el uso de marcadores de superficie individuales, ya sea por análisis histológico o por técnicas basadas en citometría de flujo. Sin embargo, nuevos marcadores de superficie identificaron varios subconjuntos funcionalmente distintos dentro de la progenitora de hígado compartimento celular / vástago. El método presentado aquí describe el aislamiento y flujo detallado análisis de citometría de subconjuntos progenitoras utilizando combinaciones de marcadores de superficie novedoso. Por otra parte, se demuestra cómo los diferentes subconjuntos de células progenitoras pueden aislarse con los métodos basados en la clasificación de alta pureza utilizando automatizado magnético y FACS. Es importante destacar que, novedosos y enzimática simplificada disociación del hígado permite el aislamiento de estas poblaciones de células raras con una alta viabilidadque es superior en comparación con otros métodos existentes. Esto es especialmente relevante para el estudio de más células progenitoras in vitro o para el aislamiento de ARN de alta calidad para analizar el perfil de expresión génica.
Introduction
La regeneración hepática se asocia sobre todo con la capacidad de auto-renovación de los hepatocitos. Sin embargo, las lesiones crónicas del hígado se producen con la activación de células progenitoras y de expansión, que se han asociado con su capacidad de diferenciarse en hepatocitos y cholangiocytes 1, 2, 3, 4. Esto es especialmente relevante porque, durante las lesiones crónicas, la proliferación de hepatocitos no es eficaz. A pesar de múltiples estudios de rastreo genético dirigidas a células progenitoras, su papel en la regeneración del hígado sigue siendo controvertido 5, 6, 7, 8. Por otra parte, la activación de las células progenitoras se ha relacionado con una mayor respuesta fibrótica en el hígado, lo que plantea dudas sobre su papel exacto en lesiones 9, 10.
La naturaleza heterogénea del compartimento de células progenitoras durante mucho tiempo ha sido sugerido por estudios de expresión génica que aislaron células progenitoras que expresan un solo marcador de la superficie celular mediante microdisección o métodos basados en la clasificación 1, 11. De hecho, recientemente, una nueva combinación de marcadores de superficie utilizando GP38 (podoplanin) inequívocamente vinculada marcadores individuales anteriores de células progenitoras a diversos subconjuntos 12. Es importante destacar que estos subconjuntos no sólo diferían en su expresión de marcadores de superficie, pero también mostraron alteraciones funcionales durante 12 lesiones.
Múltiples modelos animales se han utilizado para investigar la activación de células progenitoras y la regeneración del hígado. Parece que los distintos tipos de lesiones promueven la activación de diferentes subconjuntos de células progenitoras 12. Esto podría explicar la phenotypic divergencia de la reacción ductular observada en humanos 4. Por lo tanto, los complejos análisis fenotípicos y funcionales de las células progenitoras son fundamentales para entender su papel en las lesiones y el verdadero significado de la reacción ductular en las enfermedades hepáticas.
Además de combinaciones de marcadores de superficie, las diferencias cruciales en protocolos de aislamiento de células complican aún más las conclusiones basadas en estudios anteriores 2. Una cantidad sustancial de estudios abordaron el papel de las células progenitoras que difieren mucho en su protocolo de aislamiento (por ejemplo, la disociación de hígado (combinación de enzimas y la duración del proceso), de densidad media, y la velocidad de centrifugación) 2. Una técnica de aislamiento optimizado, proporcionando una mejor viabilidad de las poblaciones de células raras y reflexiva de la composición subconjunto, se ha desarrollado y publicado recientemente 12. El objetivo de este artículo es proporcionar una más detprotocolo ailed de este procedimiento de aislamiento de células del hígado y el análisis de subconjunto para permitir la reproducción correcta de la técnica. Además, el protocolo incluye una comparación con el método de aislamiento anterior para demostrar las diferencias en comparación con el nuevo protocolo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Inflamación del hígado y lesiones de diferentes orígenes desencadenan procesos regenerativos en el hígado que se acompañan de la expansión de células progenitoras y la activación 2, 3. Estas células progenitoras del hígado poseen características de las células madre y probablemente juegan un papel importante en el mecanismo patológico de varias enfermedades del hígado.
La heterogeneidad de las células progenitoras hep?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el Premio Fundación Kovalevskaja Sofja Alexander von Humboldt para VLK.
Materials
| RPMI | Life Technologies | 21875-034 | |
| phenol red free DMEM | Life Technologies | 31053-028 | |
| FBS | Life Technologies | 10270-106 | |
| Collagenase P | Sigma-Aldrich | 11249002001 | |
| DNAse-I | Sigma-Aldrich | 10104159001 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105041 | |
| ACK Lysing Buffer | Life Technologies | A10492-01 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025-050 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Prepare 1 % stock solution |
| 10 % BSA | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| autoMACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | add 0.5 % (v/v) BSA and store on ice |
| Phenol-red free DMEM | Sigma-Aldrich | D1145 | |
| counting Beads Count Bright | Life Technologies | C36950 | |
| PI | Miltenyi Biotec | 130-093-233 | |
| FcR Blocking Reagent | Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| anti-CD31 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-097-418 | |
| anti-CD45 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
| Dead Cell Removal Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
| anti-Biotin MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-090-485 | |
| CD64 Purified | BioLegend | 139302 | Dilution: 1:100 |
| CD16/32 Purified | BioLegend | 101302 | Dilution: 1:100 |
| CD45 APC/Cy7 | BioLegend | 103116 | Dilution: 1:200, marks hematopoetic cells |
| CD31 Biotin | BioLegend | 102504 | Dilution: 1:200, marks endothelial cells |
| ASGPR1 Purified | Bio-Techne | AF2755-SP | Dilution: 1:100, marks hepatocytes |
| Podoplanin APC | BioLegend | 127410 | Dilution: 1:1400, marks progenior cells |
| Podoplanin Biotin | BioLegend | 127404 | Dilution: 1:1400 |
| CD133 PE | Miltenyi Biotec | 130-102-210 | use 3 µl, marks progenitor cells |
| CD133 Biotin | BioLegend | 141206 | Dilution: 1:100 |
| CD34 Biotin | eBioScience | 13-0341-81 | Dilution: 1:100 |
| CD90.2 Pacific Blue | BioLegend | 140306 | Dilution: 1:800 |
| CD157 PE | BioLegend | 140203 | Dilution: 1:600 |
| EpCAM Brilliant Violet 421 | BioLegend | 118225 | Dilution: 1:100 |
| Sca-1 Biotin | Miltenyi Biotec | 130-101-885 | use 10 µl |
| Mouse IgG2b, κ PE | BioLegend | 400311 | |
| Rat IgG1 PE | BioLegend | 400407 | |
| Rat IgG2b, κ APC/Cy7 | BioLegend | 400624 | |
| Rat IgG2a, κ Biotin | BioLegend | 400504 | |
| Rat IgG2a, κ Brilliant Violet 421 | BioLegend | 400535 | |
| Syrian Hamster IgG APC | BioLegend | 402012 | |
| Syrian Hamster IgG Biotin | BioLegend | 402004 | |
| Normal Goat IgG Control Purified | Bio-Techne | AB-108-C | |
| Donkey anti-Goat IgG Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A11055 | Dilution: 1:800 |
| Streptavidin Alexa Fluor 405 | Life Technologies | S32351 | Dilution: 1:400 |
| 100 µm Filter mesh | A. Hartenstein | PAS3 | |
| LS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| QuadroMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | 130-096-343 | |
| AutoMACS Pro Separator | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
| FACS AriaTMIII | BD Biosciences | ||
| FACSDiva sofware | BD Biosciences | ||
| Polypropylene Round bottom tube | Falcon | 352063 | |
| Rneasy plus mini kit | Qiagen | 74134 | RLT lysis buffer is included |
Referencias
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