JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Divulgaciones
Acknowledgements
Materials
Referencias
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Inmunología y contagio

Meting van de T-cel alloreactiviteit Met behulp van Imaging flowcytometrie

Published: April 19, 2017
doi:
10.3791/55283
, , , , ,
1Division of Respirology, Departments of Medicine and Immunology, Toronto Lung Transplant Program, Multiorgan Transplant Program, Toronto General Research Institute,University of Toronto and University Health Network, 2Latner Thoracic Surgery Laboratories, Toronto General Research Institute,University Health Network, 3National Institutes of Health Research, Oxford Biomedical Research Centre, Translational Immunology Laboratory, NDORMS, Kennedy Institute of Rheumatology,University of Oxford, 4Transplantation Research Immunology Group, Nuffield Department of Surgical Sciences, John Radcliffe Hospital,University of Oxford

Summary

Dit document beschrijft een werkwijze voor het meten van alloreactiviteit in een gemengde populatie van T-cellen met behulp van beeldvorming flowcytometrie.

Abstract

Het meten van immunologische reactiviteit voor donorantigenen bij transplantatiepatiënten is waarschijnlijk essentieel voor de succesvolle vermindering of stopzetting van immunosuppressie zijn. De gemengde leukocyt reactie (MLR) beperkende verdunning assays en trans-vivo vertraagde hypersensitiviteit (DTH) test zijn allemaal toegepast op deze vraag, maar deze methoden zijn voorspellend vermogen en / of belangrijke praktische beperkingen die de bruikbaarheid ervan beperken beperkt. Imaging flowcytometrie is een techniek die de Multiparametrische kwantitatieve bevoegdheden van de stroming combineert cytometrie met de grafische mogelijkheden van fluorescentie microscopie. We hebben onlangs maakten gebruik van een imaging flowcytometrie benadering van het aandeel van de ontvanger T-cellen die in staat tot het vormen van volwassen immuun synapsen met donor-antigeen presenterende cellen (APC) te definiëren. Gebruik een goed gekarakteriseerde muizen harttransplantatiemodel hebben we aangetoond dat de frequentie van in vitro immunologische synapsen tussen T-APC Membrane contact gebeurtenissen sterk voorspeld allograft uitkomst in afstoting, verdraagzaamheid, en een situatie waarin transplantatie voortbestaan ​​afhankelijk is van geïnduceerde regulatoire T-cellen. De frequentie van T-APC contacten verhoogd met T-cellen uit muizen tijdens acute afstoting en verminderd met T-cellen uit muizen gesmolten reageren op alloantigeen. De toevoeging van regulatoire T cellen in vitro systeem verlaagd langdurige T-APC contacten. Kritisch, werd dit effect ook waargenomen met menselijk polyklonaal geëxpandeerd natuurlijk voorkomende regulatoire T-cellen, waarvan bekend is dat de afwijzing van menselijke weefsels in gehumaniseerde muismodellen regelen. De verdere ontwikkeling van deze aanpak kan zorgen voor een diepere karakterisering van de alloreactieve T-cel compartiment in transplantatie ontvangers. In de toekomst kan de verdere ontwikkeling en evaluatie van deze methode met behulp van menselijke cellen de basis voor assays gebruikt om patiënten voor immunosuppressie minimalisering selecteren vormen, en het kan worden gebruikt om de impact van tolerogeen metenic therapieën in de kliniek.

Introduction

Solid orgaantransplantatie heeft de zorg voor patiënten in het eindstadium van ziekten van de nieren, de lever, het hart en de longen getransformeerd. Als gevolg van verschillen in grote en kleine histocompatibiliteitantigenen echter allogene worden onmiddellijk verworpen door de ontvanger T-cellen als immunosuppressieve geneesmiddelen alleen worden gebruikt. Deze agenten hebben tal van bijwerkingen, waaronder risico's voor kanker en orgaanfalen. Een belangrijk klinisch doel is derhalve de dosis immunosuppressie te verlagen tot het minimum dat vereist is om allograft afstoting te voorkomen. Dit niveau kan variëren afhankelijk van de mate van activering van het aangeboren immuunsysteem; de mate van donor-ontvanger allo mismatch; en interindividuele verschillen in het immuunsysteem, farmacokinetiek en farmacodynamiek.

Helaas, transplantatie artsen hebben geen instrumenten hebben om nauwkeurig te kunnen beoordelen donor reactiviteit bij individuele patiënten 1. de gemengdeleukocyt reactie (MLR) kunnen donor reactiviteit detecteren, maar niet aan transplantaat uitkomst 2, 3 betrouwbare voorspelling. Beperkende verdunning assays, cytokine ELISPOTs en trans-vivo assay ofwel meten een beperkt aantal reacties of niet praktisch 4, 5, 6, 7, 8 .Gene expressieprofielen gebleken handtekeningen voortvloeien uit operationele tolerantie 9, 10, 11, 12 en afwijzing 13, 14, 15, maar deze zijn niet altijd generalizable in populaties 16 en kan uiteindelijk beperkt nut bij individuele patiënten. Sequentie-gebaseerde analyses van de T-celreceptor (TCR) van T-cellen in het perifere bloed 17 of prolifererende in de MLR 18 zijn ontwikkeld maar vereisen verdere validatie.

Conceptueel zou het wenselijk zijn om een ​​test waarmee de eerste noodzakelijke stappen ontvangende T-celactivering detecteert door een donor antigeen. Aangezien het kweken van cellen in dagen (zoals in de MLR) kunnen artefacten introduceren dergelijke test zou idealiter niet het meten van stroomafwaartse gebeurtenissen zoals proliferatie of effectorfunctie vereist. Ook zou het echter wenselijk zijn om de test af te hangen van een element van T-celfunctie, aangezien louter beschrijvend evaluaties (Bijvoorbeeld TCR sequentie) kan geen onderscheid maken tussen anergic functionele T-cellen.

Talrijke studies hebben aangetoond dat langdurige T-APC contact is nodig voor de vorming van een immuun synaps, dat een essentieel eerstebetreedt de T-celrespons 19, 20, 21, 22. We hebben onlangs gemeld dat tijdens dynamiek in vitro time lapse imaging, ongeveer 5-10% muizen- CD4 + T cellen vormen langdurig contact met allogene beenmerg afgeleide dendritische cellen (BMDCs) 23. De frequentie van langdurig contact was verhoogd bij dieren die een ent verworpen, terwijl muizen die eerder tolerant dezelfde antigenen gesmolten, bleef op niveaus waargenomen in muizen untransplanted 23. Langdurige interacties gereduceerd in aanwezigheid van Tregs ontvanger en meer in hun afwezigheid en we waarnamen soortgelijke verschijnselen met menselijke T-cellen en allogene monocyten afgeleide DCs (MoDCs) 23.

Echter, de opsomming van langdurige contacten binnen een polyklonale T-cel population is tijdrovend en arbeidsintensief. We hebben daarom gebruik gemaakt van beeldvorming flowcytometrie aan allogene immuun synaps formatie te onderzoeken. Beeldvorming doorstroomcytometrie omvat de multiparametrische data acquisitie en analyse mogelijkheden van conventionele flowcytometrie met de single-cell imaging mogelijkheden van fluorescentiemicroscopie. Deze techniek is gebruikt door andere onderzoekers om immune synapsvorming bestuderen door monoklonaal T-cellen 24, 26, 27 of bij aanwezigheid van superantigenen 28. Bij dergelijke instellingen is echter de frequentie reageren T-cellen varieert 30-100%, terwijl alloreactieve T-cellen in het algemeen worden geschat op 5-15% van de totale T-cel repertoire 29, 30, 31, 32 representeren. Belangrijk is dat we laten zien dat imaging stroom kan cytometrie av producerenery vergelijkingsmaatstaf voor alloreactieve T-celfrequentie 23 en dat veranderingen in de synaps frequentie binnen een polyklonale T-cel populatie zijn voorspellend transplantaat uitkomst 23. Op dit moment is deze aanpak is geoptimaliseerd om de directe alloreactiviteit van CD4 + T-cellen te meten, maar in principe kan het ook worden ontwikkeld om CD8 + T-cellen en de indirecte route te onderzoeken. Indirect alloreactiviteit wordt aangenomen dat het in toenemende mate relevant zijn op langere tijden na transplantatie 33 geworden. Momenteel ontwikkelen we deze methode om menselijke cellen, waardoor voor het testen van patiënten te gebruiken. Dus in de toekomst, de algemene benadering kan nuttig zijn voor de functionele evaluatie van T-cel responsen in transplantatie ontvangers voor transplantatie; direct na transplantatie; en op de lange termijn, wanneer drug minimalisering wordt een belangrijk doel.

Protocol

1. Bereid reagentia en materialen Benodigde Bereid fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) die 2% foetaal runderserum (FBS) ( "wasbuffer"). Bereid PBS met 2% FCS bevattende 0.1% ionogeen detergent ( "perm-wasbuffer", zie tabel of Materials). Bereid PBS met 1,5% formaldehyde. LET OP: LET OP! Formaldehyde is bijtend en potentieel kankerverwekkende en moeten worden behandeld, terwijl het dragen van persoonlijke beschermingsmiddelen. Bereid PBS met 2% FBS en 0,5 mM ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) voor magnetische celscheiding ( "MCS buffer"). Bereid 50 pg / ml falloïdine-fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC-Phalloidin) in dimethylsulfoxide (DMSO). Maak een 1 mg / mL nucleaire kleurstof (bijvoorbeeld 1 mg / ml 7-amino-actinomycine D (7-AAD) in DMSO of bis-benzimide kleurstof, zie tabel of Materials) in DMSO. Bereid fluorochroom gemerkte antilichamen die geschikt zijn voor de cellen van belang ende beeldvormende stromingscytometer. Verkrijgen dierlijke weefsels (bijvoorbeeld lymfeknopen en milt) als bron van T-cellen en allogene dierlijke weefsels (bijvoorbeeld, milt en beenmerg) als een bron van antigenpresenterende cellen of progenitorcellen. Bereid celkweekmedium (bijv Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 of Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% FBS), 50 uM 2-mercaptoethanol, penicilline en streptomycine en het verkrijgen van 24- en / of 96- goed celcultuur platen. 2. Bereid Antigen-presenterende cellen LET OP: In theorie kan elk APC bevolking worden onderzocht met deze methode. Onrijpe muizen beenmerg afgeleide dendritische cellen (DCs) als APC's werden opgeroepen voor dit geval. Veel protocollen aanwezig voor het genereren van deze cellen (bijvoorbeeld Referenties 34 en 35). In het kort werd het volgende protocol toegepast. Flush merg van dijbenen en scheenbenen in RPMI 1640 of DMEM. Voorbij de gesuspendeerde cellen door een 70 urn cel zeef met kleine stukjes bot en afval. Pellet de cellen door centrifugatie en vervolgens lyseren van rode bloedcellen onder toepassing van een ammoniumchloride-buffer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Pellet de cellen door centrifugatie (400 x g, 5 min) en resuspendeer de celpellet. Was de cellen in 5-10 ml wasbuffer, pellet door centrifugeren (400 x g, 5 min) en resuspendeer de celpellet. Verrijken hematopoietische voorlopers in een celscheidingskolom door het merken van de cellen met gebiotinyleerd anti-CD3 (5 ug / ml) anti-B220 (5 ug / ml), anti-MHC klasse II (1 pg / ml) en anti-CD11b (5 ug / ml) antilichamen. Pellet de cellen door centrifugatie (400 x g, 5 min) en resuspendeer de celpellet. Incubeer de cellen met anti-biotine magnetische microparels (zie tabel materiaalkunde) bij 4 ° C gedurende 10 minuten. Was pellet en de cellen (400 xg, 5 min) en opnieuw suspend ze in 1 ml buffer MCS alvorens de gemerkte cellen onder toepassing van een grote positieve selectie (LS) magnetische celscheidingskolom geprimed met 3 ml buffer MCS en in de magneet. Was de kolom 3 maal met 3 ml buffer MCS; de doorloop de gewenste cellen bevat. Cultuur van de cellen die door de kolom passeren gedurende 6 dagen in RPMI 1640 of DMEM aangevuld met 2 ng / ml recombinant muizen granulocyt macrofaag-koloniestimulerende factor (GM-CSF) en 2 ng / ml recombinant humaan transformerende groeifactor β1 (TGFB1) . Vervang de helft van het medium elke 2 dagen met vers compleet medium dat 2 ng / ml GM-CSF en TGFB1. OPMERKING: Human TGFB1 heeft activiteit in muizencellen. De gegevens zijn gegenereerd met behulp van deze onvolwassen DCs. Andere cellen (bijvoorbeeld B-cellen en rijpe DC) is geschikt als APC's, maar zijn niet onderzocht met dit onderzoek. Cryopreserve DCs in 90% serum / 10% DMSO en bewaar in vloeibare stikstof; terug opde dag van gebruik. Voorafgaand aan het gebruik, tel het aantal levensvatbare DCs in een hemocytometer met behulp van trypan blauw uitsluiting. Resuspendeer de celpellet in kweekmedium op geschikte dichtheid (zie stap 4.1) voor gebruik in hoofdstuk 4. 3. Bereid T-cellen Gebruik negatieve selectie methoden om per ongeluk te voorkomen dat het verzenden van activerende of remmende signalen naar de cellen. Opmerking: In dit voorbeeld worden CD4 + -T-cellen bereid voor analyse. CD4 + T-cellen te bereiden van de muis milt, mash de milt door een 70-um cel zeef met de plunjer van een injectiespuit. Was de cel zeef met wasbuffer. Pellet de gesuspendeerde cellen door centrifugatie (400 x g, 5 min) en vervolgens lyseren van de rode cellen door het hersuspenderen van de pellet in een ammoniumchloride-buffer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Pellet de cellen door centrifugatie (400 x g, 5 min) en resuspendeer de pellet. Was de cels in 5-10 ml wasbuffer en pellet door centrifugeren (400 x g, 5 min). Resuspendeer de pellet. Vlekken op de cellen met gebiotinyleerde antilichamen tegen CD8, belangrijk histocompatibiliteitscomplex klasse II (MHC II, 1 ug / ml) en CD19 (5 ug / ml). Incubeer gedurende 10 min bij 4 ° C. Was de cellen in 10 ml wasbuffer en pellet door centrifugeren (400 x g, 5 min). Resuspendeer de pellet. Incubeer de cellen met anti-biotine magnetische microparels (zie de Tabel Materials) volgens de aanwijzingen van de fabrikant. Was de cellen in 10 ml wasbuffer en pellet door centrifugeren (400 x g, 5 min); resuspendeer de pellet. Resuspendeer de cellen in 1 ml buffer MCS en verrijken de CD4 + -T-cellen op een magnetische celscheidingskolom geprimed met 3 ml buffer MCS op een magneet. Was de kolom 3 maal met 3 ml buffer MCS. Kolom doorstroom wordt de verrijkte T-cellen bevatten. Door standaarddebiet cytomeproberen, beoordelen T-cel zuiverheid met een bepaalde hoeveelheid van de negatief geselecteerde cellen. Vlekken op de cellen met behulp van een fluorochroom-streptavidine conjugaat en een antilichaam of antilichamen (één biotine gemerkte cellen die moeten worden verwijderd op de kolom te identificeren) aan de T-celpopulatie (CD4 in dit geval) te identificeren; een zuiverheid van ≥85% aanvaardbaar 23. Tel de T-cellen in een hemocytometer door trypan blauw exclusie (≥90% levensvatbaarheid zijn). OPMERKING: MCS buffer bevat EDTA, die vóór de test moeten worden verwijderd. Hiervoor pellet van de cellen door centrifugatie (400 x g, 5 min) en wassen in 1 ml wasbuffer. Pellet de cellen opnieuw (400 xg, 5 min) en resuspendeer in kweekmedium op geschikte dichtheid (zie stap 4.1). 4. Co-incubeer T-cellen en DCs Zaad T-cellen en DCs bij een 2: 1 T: DC verhouding in een 24 putjes of 96 putjes celcultuurplaat. Verzekeren dat het uiteindelijke kweekvolume is ≤500 pl 24-putjesplaten of ≤50 pl 96-well platen. OPMERKING: Kleinere volumes stimuleren cel-cel interacties en laat ruimte voor verdere fixatie buffer. Passen precieze celaantallen empirisch, maar als een algemene richtlijn gebruikt 1 x 10 6 T-cellen en 0,5 x 10 6 DCs per putje (plaat met 96 putjes). Deze moeten worden beschouwd als het minimum aantal cellen, omdat het gebruik van minder cellen maakt opsomming van het immuunsysteem synapsen moeilijk. Om cel aantallen te verhogen, het opzetten van repliceren putten en zwembad na stap 5 (fixatie). OPMERKING: Bij het instellen van repliceren putten, is het raadzaam om DCs zaad in alle van de putten en vervolgens zaad T-cellen in alle van de putten; Dit minimaliseert verschillen in incubatietijd tussen putjes. Incubeer de plaat gedurende 4 uur bij 37 ° C in een 5% CO2 atmosfeer. e_title "> 5. Fix Cellen in Plate Voeg 3 maal het kweekvolume van 1,5% formaldehyde in PBS aan elk putje en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 30 min; tt is belangrijk om cellen te repareren voordat ze uit de plaat om de verstoring van cel-cel interacties minimaliseren. Transfer cellen in de plaat in buizen voor daaropvolgend wassen en vlekken. In dit stadium, gereserveerd extra cellen voor single-vlek controles. Afgezien van deze controles moeten de hele cultuur worden gekleurd met het antilichaam cocktail (zie stap 4.1.1). 6. Stain Cellen Vlek cellen in 100 pl wasbuffer bevattende een cocktail van het gewenste fluorochroom geconjugeerde antilichamen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht. OPMERKING: De cocktail bestaat uit T-cel-specifieke en APC-specifieke antilichamen. Fluorochromen moeten zodanig worden gekozen dat deze kunnen worden onderscheiden met behulp van de configuratie van de beeldvormende stromingscytometer. in tHij experimenten hier, blue fluorofoor geconjugeerd CD11b (5 ug / ml, zie de Tabel Materials) en APC-geconjugeerd CD90.2 (5 ug / ml) gebruikt. Was de cellen in 1 ml wasbuffer en centrifugeer 5 min bij 400 x g. Decanteren van het supernatans. Resuspendeer de cellen in perm-wasbuffer bevattende phalloidin FITC ten 0,05-0,5 gg / ml en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur beschermd tegen licht. OPMERKING: Phalloidin FITC concentraties van ongeveer 0,1 ug / ml werken goed voor muizencellen, maar de juiste concentratie wordt verwacht te variëren per leverancier, celtype en imaging flowcytometer. Was de cellen in 1 ml Perm / wasbuffer en centrifugeer 5 min bij 400 x g. Decanteren van het supernatans. Resuspendeer de cellen in Perm / wasbuffer bevattende nucleaire kleurstof bij de geschikte concentratie (bijvoorbeeld ongeveer 25 ug / ml 7-AAD) en incubeer 30 minuten bij kamertemperatuur beschermd tegen licht. Was de cels in 1 ml Perm / wasbuffer en centrifugeer 5 min bij 400 x g. Decanteren van het supernatans. Was de cellen eenmaal in wasbuffer pellet en resuspendeer in 50-100 pl wasbuffer, overbrengen van de cellen naar kleine, afgesloten microcentrifugebuizen. Overgaan tot gegevensverwerving onmiddellijk of bewaar de cellen bij 4 ° C beschermd tegen licht gedurende enkele dagen vóór de verwerving van het grafisch stroomcytometer. OPMERKING: Cellen zijn met succes op deze manier opgeslagen voor maximaal 7 dagen. Langere opslag kan mogelijk zijn, maar is niet getest. 7. Acquire Gegevens Initialiseren en configureren van de imaging flowcytometer volgens de instructies van de fabrikant. Zorgen voor stabiliteit van de stroming kern voorafgaand aan het verzamelen van gegevens. Reserveren een kanaal voor het helderveld verkrijgen. Verwerven één vlek besturingsdata met helderveld kanaal uitgeschakeld. Klik op de knop "Load" en insert een buis met een volledig gekleurd monster (een monster dat is gekleurd met aangegeven fluorochromen) in de houder. In het venster "werkruimte", selecteren en een nieuwe scatterplot de beeldverhouding via stippellijn gate singlets waarbij de aspectverhouding dicht bij 1. Een nieuwe scatterplot voor elk gebruikt kanaal (intensiteit van het kanaal op de horizontale as) . Voor elk fluorochroom, controleer de positieve populatie en, indien nodig, pas de laser spanning in het vak "verlichting". Lossen van de buis en laadt de eerste single-gekleurde tube. In het vak "Acquisition Settings", typt u de naam monster en stel het aantal gebeurtenissen die moeten worden verzameld; Als het een enkele vlek (compensatie controles), 1000 – 2000 events volstaan. Bij "kanalen", selecteert de kanalen die elk monster werd gekleurd met. Voor single-vlek controles, worden alle kanalen worden geselecteerd met brightfield en zijwaartse verstrooiing uit. Klik op de "Record" knop onder het vak "Acquisition"; wanneer het aantal gebeurtenissen het gespecificeerde drempel bereikt, wordt overname automatisch. Klik op de "Return" knop aan de buis te lossen. Herhaal stap 7.2.4 – 7.2.6 voor elke controle single-vlek. Afhankelijk van de cytometer en software, kan het niet mogelijk zijn om alle van de in figuur 1 tijdens acquisitie poorten ingesteld (nauwkeuriger gating wordt uitgevoerd tijdens de analyse; zie hoofdstuk 8). Verwerven monsters voor één gekleurde monsters (stap 7.2), maar in het vak "kanalen" Selecteer alle kanalen die nodig zijn, waaronder de helderveld kanaal. Voor de opname van gegevens, controleert om te bevestigen dat het kanaal intensiteit geschikt zijn voor het identificeren van de gewenste celpopulaties is. Zo niet, stel de laser instellingen en opnieuw opnemen single-vlek controles met behulp van de nieuwe instellingen, zoals beschreven in stap 7.2. voor elkmonster, het verwerven van enkele tienduizenden van de gebeurtenissen. LET OP: In de meeste omstandigheden, cel-cel contact events zijn een kleine minderheid van het totale aantal cellen (de meeste zijn enkele cellen). In het algemeen is het gewenst ten minste 100 gebeurtenissen in het uiteindelijke membraan contact gate. 8. Analyseer de gegevens Analyseer de verworven op de beeldvorming flowcytometer met behulp van analytische software gratis beschikbaar via de website van de fabrikant van de data (een gebruiker rekening moet worden gecreëerd; zie de tabel van Materials). Figuur 1. Gating strategie gebruikt voor het identificeren Alloreactieve Immune Synapses. A. In-brandpunt events gepoort uit alle beurzen van herziening celbeelden op basis van het kwadratisch gemiddelde van de veranderingssnelheid van de beeldintensiteit profiel (Gradient RMS) met de helderveld Channel (Channel 4, CH04), zoals beschreven in de tekst. B. Onder de in-focus events, wambuizen onderscheiden van enkelvoudige cellen door het uitzetten van de aspectverhouding versus gebied voor de helderveld kanaal. Enkele cellen nabij de aspectverhouding van 1 geclusterd en een kleiner gebied, terwijl doubletten dicht bij 0,5 en een groter gebied. C. Fluorescentie-intensiteit van de APC (in casu een dendritische cel [DC] marker, CD11c) wordt vervolgens uitgezet tegen de fluorescentie-intensiteit van de T-cel marker (in casu CD90.2) en dubbel-positieve gebeurtenissen gepoort. Randen van de poort kan worden verfijnd door het bekijken van beelden van gebeurtenissen bij de grens. D. T-APC doubletten worden vervolgens verfijnd zodat ze slechts één APC bevatten uitzetten van de verhouding ten opzichte van de oppervlakte van de APC merker (CD11c, Ch02). E. Deze enkelvoudige-APC doubletten worden vervolgens verfijnd zodat ze slechts één T-cel bevatten uitzetten van de verhouding ten opzichte van de omgevingvan de T-cel marker (CD90.2, CH06). F. Tenslotte gebeurtenissen die slechts twee kernen worden geselecteerd door het uitzetten van een histogram van de spotteling op het kanaal nucleaire kleurstof (7-AAD, CH05) en gating gebeurtenissen die slechts 2 7-AAD-positieve vlekken (dwz kernen) bevatten. De gebeurtenissen in deze poort worden geanalyseerd membraan contact en synapsvorming, zoals beschreven in figuur 2. De gegevens werden geanalyseerd op een blinde wijze met betrekking tot toegewezen behandeling en komen uit een eerder gepubliceerde 23 experiment. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. OPMERKING: De gating strategie wordt beschreven in deze sectie en is weergegeven in figuur 1. Analyse van beeldvorming flowcytometrie gegevens moeten worden uitgevoerd op een blinde wijze ten opzichte toegewezen behandeling. Hoewel wij geloven dat het immuunsysteem synapsen en niet-synaptic contacten worden in het algemeen gemakkelijk onderscheiden (zie hieronder en Figuren 2 en 3), blindering moet vertekening die door de subjectiviteit inherent aan beeldanalyse minimaliseren. Genereer een vergoeding matrix door het laden van de single-vlek controle data-bestanden in de wizard compensatie. Na het laden van de interne gekleurde bestanden selecteert de fluorescerende kanalen gebruikt in het experiment. OPMERKING: De software genereert automatisch een vergoeding matrix, maar dit moet handmatig worden gevalideerd om ervoor te zorgen dat de juiste positieve populaties werden geselecteerd. Dubbelklik op een waarde in de matrix en voeg de grafiek om de analyse gebied. Maak een nieuwe poort indien nodig bij geen dode cellen / wambuizen / valse positieven uit te sluiten; Deze nieuwe verfijnde positieve populatie kan worden geselecteerd in de matrix box aan het keuzemenu voor elk kanaal. Herhaal deze procedure voor elk kanaal. Klik op "Finish" om de compensatio reddenn matrix (.ctm bestand). Verkrijgen van een gegevensanalyse bestand (.daf) uit het ruwe bestand (.rif) door het laden van het bestand in .rif analysesoftware en toepassen van de compensatie matrix. Zodra de gegevens zijn geladen, voert poorten T-cel-contact APC gebeurtenissen te identificeren. Opmerking: Een typische gating strategie behelst het identificeren scherpgestelde gebeurtenissen, selecteren doubletten basis van grootte criteria (het gebied versus aspectverhouding van het evenement), en de selectie van T-cel-APC doubletten als gebeurtenissen die dubbel positief voor de T-cel en APC merkers (Figuur 1A-C). OPMERKING: De aspectverhouding is de verhouding van de breedte van een gebeurtenis zijn hoogte van discriminatie van afzonderlijke cellen (verhouding dichtbij 1) van doubletten (verhouding dichtbij 0,5) mogelijk maakt. Identificeren in-focus gebeurtenissen door het uitzetten van het kwadratisch gemiddelde van de veranderingssnelheid van de beeldvormend intensiteitprofiel (gradiënt RMS) in helderveld kanaal (Figuur 1A). Klik op the gradiënt RMS histogram naar cel gebeurtenissen in afzonderlijke bakken vertonen en plaats een gate uitzondering out-of-focus events. Zet de zone tegenover de beeldverhouding van het helderveld kanaal en stelt een poort die doubletten identificeert op basis van vorm en afmeting (figuur 1B) gebeurtenis. Beoordeling van beelden van gebeurtenissen net binnen en buiten de grens van deze poort kan helpen de analist om de grootte en positie van de poort te verfijnen. Vervolgens construct een grafiek van deze doublet gebeurtenissen waarbij de intensiteit van de T-cel marker wordt op één as en de intensiteit van de APC markering op het andere. Teken een T-APC doublet poort met gebeurtenissen positief voor beide markers. Onder de T-cel-APC doublet evenementen, selecteert gebeurtenissen die slechts één T-cel en een APC bevatten. Doe dit door het uitzetten van de aspectverhouding versus gebied voor de APC marker en door gating op doubletten met een APC (figuur 1D). Zet de aspect ratio versus gebied voor de T-cel-markER en hek aan doubletten met een T-cel (figuur 1E). OPMERKING: Verdere verbetering kan worden verkregen door het uitzetten van een histogram van de spotteling functie zoals toegepast op nucleaire fluorescentie en gating vlek op gebeurtenissen met slechts twee plaatsen (Figuur 1F). In sommige gevallen zullen de twee cellen binnen een doublet niet in contact; om cellen te identificeren in contact met elkaar vast objectmaskers voor APC en T-cellen. Gebruik de optie "Maskers" in het menu Analyse van de Maskers manager te openen en definieer een nieuw masker. Typ een naam, zoals "T-cel object masker." Klik op de "Functie" knop en in het dialoogvenster, kies "Object." Selecteert het kanaal waarin de T-cel merker gedetecteerd (bijvoorbeeld CH06). Klik op "OK". OPMERKING: "Object (M06, CH06, Tight)" wordt weergegeven in het Function vak. Deze standaard object masker meestal works goed maar kan optimalisering vereisen. Herhaal dit proces tot een APC objectmasker in het juiste kanaal te maken. Na het identificeren van de APC en T-cellen maskers, vast membraan contact door het uitzetten van T-cel marker fluorescentie-intensiteit in het APC objectmasker tegen APC fluorescentie-intensiteit in de T-cel objectmasker. Op deze curve trekt een poort die alleen cellen in contact met elkaar omvat. OPMERKING: Doorgaans zijn er vrij duidelijk dubbelpositieve en dubbel-negatieve populaties (Figuur 2A). De grens tussen de dubbel-positieve en dubbel-negatieve populatie kan door de herziening van helderveld beelden van de cellen in het grensgebied om ervoor te zorgen dat cellen in contact zijn binnen de poort en dat cellen die niet in contact zijn uitgesloten worden ingesteld. In deze fase handmatig phalloidin FITC beelden van gebeurtenissen te beoordelen op deze poort rijpe immune synapsen van eenvoudige cel-cel contact te onderscheiden. Use de "tag beelden" functie om deze beelden te markeren. Opmerking: Het percentage gemerkte gebeurtenissen (immune synapsen) in deze poort kan worden gebruikt als een index van alloreactiviteit direct in de T-celpopulatie onderzocht.

Representative Results

Deze methode werd gebruikt om te onderzoeken CD4 + T-cellen bij muizen alloreactiviteit rendered tolerant donor allo-antigenen voor heterotopische harttransplantatie. CBA-muizen (H-2k) kregen een toleriserende protocol bestaat uit een donor-specifiek (B6, H-2b) bloedtransfusie gecombineerd met een niet-afbrekende CD4 antilichaam één maand voorafgaand aan het ontvangen van een B6 harttransplantatie. Dit protocol leidt tot langdurige allograftoverleving die afhankelijk Foxp3 + regulatoire T-cellen 36, 37. Zeven dagen na de transplantatie, werden milt CD4 + T-cellen verkregen uit tolerant en niet tolerant ontvangers van allotransplantaten en cardiale B6 werden samen geïncubeerd met B6 beenmerg afgeleide DC's volgens dit protocol. Figuur 2 toont representatieve gegevens van dit experiment. Het membraan contact poort is getoond in figuur 2Een met groene crosshairs geplaatst op een synaptisch gebeurtenis (linker panel, 1) en op niet-synaptische event (rechter paneel). Figuur 2B toont de helderveld en fluorescentie kanalen voor dit evenement. Om vertekening te verminderen, werden de gegevens geanalyseerd door een waarnemer geblindeerd voor de behandeling opdracht 23. Zoals aangetoond in verschillende voorbeelden in figuur 3, zowel van niet-tolerant (Figuur 3A-B) en tolerant (Figuur 3C-D) CBA ontvangers van B6 harten, synapsen zijn gemakkelijk te onderscheiden van niet-synaptische contacten door de aanwezigheid van een dichte FITC-positieve nok van het T-APC interface. Deze resultaten tonen dat visuele detectie van immunologische synapsen door ontvanger T-cellen meeloopt met de mate van alloreactiviteit in de ontvanger. Figuur 2. Identificatie van T-APC wambuizen met membraanContact en Immune Synapse Formation. Gebeurtenissen in de laatste doublet poort (Figuur 1F) geanalyseerd. A. T-cel marker fluorescentie in het APC object masker is uitgezet tegen APC marker fluorescentie in het DC object masker. Sommige doublet evenementen hebben een APC en een T-cel zonder cel-cel contact en verschijnen in de linker benedenhoek van het perceel (beelden niet getoond). Een membraan contact hek kan dus worden geconcludeerd dat alleen doubletten waarbij T-cellen en APC's in contact omvat. Beelden van elke gebeurtenis in deze poort worden beoordeeld op tekenen van actine cytoskelet omlegging in de falloïdine-FITC kanaal en kan worden gelabeld met de analysesoftware. Het linkerpaneel toont een immuun synaps gebeurtenis (label 1 en via groene dradenkruis), terwijl het rechter paneel toont een membraan contact gebeurtenis zonder immuno synapsvorming (label 2 en via groene dradenkruis). De bepaling de vorming van synapsen moet handmatig herziening van dezebeelden, getoond in B. B. De bovenste rij toont helderveld en fluorescentie kanaal afbeeldingen voor een doublet met een immunologische synaps (komt overeen met 1 event in A); de onderste rij toont een doublet met membraan contact, maar ontbreekt vorming synaps (komt overeen met 2 event in A). De gegevens werden geanalyseerd op een blinde wijze met betrekking tot toegewezen behandeling en komen uit een eerder gepubliceerde 23 experiment. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. Figuur 3. Voorbeelden van T-APC Synapse Formation. CBA muizen ontvingen cardiale allotransplantaten van B6 donoren na ofwel geen voorbehandeling (AB) of na inductie met B6 volbloed onder geleide van een niet-afbrekende anti-CD4-antilichaam ( <st rong> CD). Na 7 dagen werden de milt CD4 + T-cellen getest op synaps formatie met B6 DCs. A. Drie voorbeelden van niet-synaptische doubletten met membraan contact van een niet-tolerant gemaakte dier. B. Drie voorbeelden van immunologische synapsen van een niet-tolerant gemaakte dier. C. Drie voorbeelden van niet-synaptische doubletten met membraan contact van een tolerant gemaakte dier. D. Drie voorbeelden van immunologische synapsen van een tolerant gemaakte dier. synapsvorming wordt aangegeven door de aanwezigheid van een heldere, FITC-positieve nok van het T-APC interface (CH03). De gegevens werden geanalyseerd op een blinde wijze met betrekking tot toegewezen behandeling en komen uit een eerder gepubliceerde 23 experiment. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. ays "> Antilichaam / Dye fluorochrome Kanaal Concentratie CD11c eF450 CH02 5 ug / ml Titreer empirisch CD90.2 APC CH06 5 ug / ml Titreer empirisch phalloidin FITC CH03 0,05-0,5 gg / mL 7-AAD – CH05 25 ug / ml Tabel 1. Antilichamen en kleurstoffen gebruikt in deze studie. Fluorochroom-geconjugeerde antilichamen, kleurstoffen, leveranciers, en de aanbevolen concentraties zijn weergegeven in de tabel. De beeldvormende flowcytometer kanaal werd gebruikt om elk fluorochroom detecteren wordt ook getoond in de tabel.

Discussion

Imaging flowcytometrie is gebruikt om immune synapsvorming tussen monoklonale T-cellen en APC's of bij aanwezigheid van superantigenen 24, 25, 26, 27, 28 tonen. Deze methode maakt gebruik van het feit dat na een productieve T-cel-APC contact, de T-cel herschikt het actine cytoskelet polariserende deze naar het contactoppervlak 21. Deze herrangschikking treedt niet zonder TCR-signalering, en daarom is een vroege correlaat van T-celactivering 19, 20, 21. De hier gepresenteerde methode past deze benadering voor de meting van alloreactieve T-cel frequentie polyklonale T-celpopulaties. Als zodanig kan het in de toekomst dienen als basis voor de ontwikkeling van assays voor donor reactivi ty in klinische transplantatie.

Hoewel directe vergelijkingen nog niet zijn gedaan, wordt de detectie van alloreactieve immunologische synapsen superieure voorspellende waarde dan de conventionele MLR hebben. Zo heeft voorgaand werk aangetoond dat het tolerant makende hierboven beschreven protocol, de resultaten van de MLR niet betrouwbaar correleren met transplantaat uitkomst 2.

Een aantal tests zijn ontwikkeld voor het operationeel tolerant staat bij de mens 9, 10, 11, hoewel deze niet effector celfunctie te meten in reactie op allo-antigeen. Daarentegen IFNy ELISPOT-assays 8 handeling effector T-celfunctie, maar kan het volledige spectrum van cytokine secretie acute en chronische transplantaatafstoting relevant kunnen zijn, zoals IL-17 38 niet vangen,> 39. De beperkende verdunning assay 4, hetgeen arbeidsintensief, en de trans-vivo bepaling 6, waarbij muizen vereist aanzienlijke praktische beperkingen die hun toepassing in een klinische omgeving zou belemmeren. Recente verbeteringen van de analyse van prolifererende cellen gebruik TCR sequentieanalyse van T-cellen reageren in de MLR kunnen waardevol zijn, maar net als de test hier gepresenteerde verder geldig worden in klinische studies 18, 40.

Verdere ontwikkeling van het immuunsysteem synaps detectie-assay vereist dat een aantal belangrijke vragen worden beantwoord. Ten eerste, de assay zoals ontwikkeld meet alleen rechtstreekse alloreactiviteit. De directe weg omvat de presentatie van allogene MHC / peptidecomplexen op APC-afgeleide donor. Deze worden meestal snel geëlimineerd na transplantatie en na allo-antigen presentatie is Carried door APCs ontvanger presenteren intact donor MHC (semi-directe route) of verwerkt donorantigenen op zelf MHC (indirecte route). De indirecte route is een belangrijke factor van chronische allograftafstoting 33, 41.

In principe zou het mogelijk zijn indirecte immunologische synapsen detecteren met deze test, maar indirect alloreactieve T-cellen een veel lagere frequentie dan directe 42, 43, zodat de analyse van een groter aantal gebeurtenissen vereist. Een tweede overweging is dat we in deze assay getest met behulp van CD4 + -T-cellen, terwijl CD8 + T-cellen ook een belangrijk onderdeel van het anti-donor respons. Wederom moet het mogelijk zijn om CD8 + T-cel-APC synapsen met deze werkwijze gedetecteerd. Een andere beperking is dat de methode vereist de handmatige controle en analyse van cel-beelden in de laatste membrane contact gate, en we zijn momenteel bezig met de automatisering van deze stap.

Ten slotte is de methode vereist het testen en ontwikkeling bij de mens, en voorstudies met menselijke monsters worden momenteel uitgevoerd. Verdere fenotypische T-cel subgroep analyse (dat wil zeggen, effector, geheugen, regelgeving, enz.) In combinatie met de detectie van immunologische synapsen in transplantatie ontvangers zou een krachtige aanpak vormen voor het karakteriseren van de alloreactieve T-cel repertoire en zal een belangrijk aandachtspunt zijn voor toekomstwerk.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

SCJ werd ondersteund door een Internationale Vereniging voor Hart-en Lung Transplantation Research Fellowship en een Royal College of Physicians en Chirurgen van Canada Detweiler Reizen Fellowship.SM werd mede ondersteund door een International Society for Heart and Lung Transplantation Career Development Award (tot SCJ). SS werd gesteund door de National Institutes of Health Research Oxford Biomedical Research Centre.JH is de ontvanger van een Kidney Research UK Senior Non-Clinical Fellowship. Dit werk werd gefinancierd door de volgende subsidies aan AB en KW: een Wellcome Trust Program Grant (082519Z07Z), een British Heart Foundation Program Grant (PG / 10 / 62,28504), en het EU-kaderprogramma 7 (een studie; BioDRIM). De auteurs willen Michael Parsons en de Flow Cytometry Core Facility op de Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Sinai Health System, Toronto bedanken voor het verlenen van toegang tot en ondersteuning bij de ImageStream Mark X instrument.

Materials

Phosphate-buffered saline Various Varies
Ethylenediamenetetraacetic acid, 0.5M solution Thermo Fisher Scientific AM9260G
Triton X-100 nonionic detergent Sigma-Aldrich X100
Beta-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D8418
Formaldehyde Sigma-Aldrich F1635 Solution is 37% formaldehyde and so must be diluted 25 times for 1.5% solution
Cell strainers, 70 μm pore size Fisher Scientific 08-771-2
Phalloidin-fluorescein isothiocyanate Sigma-Aldrich P5282
7-aminoactinomycin D Thermo Fisher Scientific A1310 Reconstitute in DMSO
Allophycocyanin-conjugated anti-mouse CD90.2 eBioscience 17-0902
Pacific blue-conjugated anti-mouse CD11b eBioscience 48-0112 Pacific blue has been replaced by eFluor 450
Biotinylated anti-mouse CD3 eBioscience 13-0032
Biotinylated anti-mouse MHC class II eBioscience 13-5321
Biotinylated anti-mouse B220 eBioscience 13-0452
Biotinylated anti-mouse CD8 eBioscience 13-0081
Biotinylated anti-mouse CD19 eBioscience 13-0193
Anti-biotin microbeads Miltenyi Biotec 130-090-485
LS columns Miltenyi Biotec 130-042-401
MidiMACS magnetic cell separator MIltenyi Biotec 130-042-302
recombinant mouse GM-CSF Peprotech 315-03
recombinant human TGFβ1 Peprotech 100-21 Human TGFβ1 has activity on mouse cells
Amnis ImageStream X Mark II Amnis/EMD Millipore N/A Imaging flow cytometer; details available at http://www.emdmillipore.com/
IDEAS Software Amnis/EMD Millipore N/A Free download (registration required): https://www.amnis.com/index.php/page/Display/login%20%20
Cell culture medium  Various Varies
Fetal bovine serum Various Varies
Cell culture plates Various Varies
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referencias

  1. Cravedi, P., Heeger, P. S. Immunologic monitoring in transplantation revisited. Curr Opin Organ Transplant. 17 (1), 26-32 (2012).
  2. Pearson, T. C., et al. The assessment of transplantation tolerance induced by anti-CD4 monoclonal antibody in the murine model. Transplantation. 55 (2), 361-367 (1993).
  3. Strober, S., Benike, C., Krishnaswamy, S., Engleman, E. G., Grumet, F. C. Clinical transplantation tolerance twelve years after prospective withdrawal of immunosuppressive drugs: studies of chimerism and anti-donor reactivity. Transplantation. 69 (8), 1549-1554 (2000).
  4. Fussell, S. T., Donnellan, M., Cooley, M. A., Farrell, C. Cytotoxic T lymphocyte precursor frequency does not correlate with either the incidence or severity of graft-versus-host disease after matched unrelated donor bone marrow transplantation. Transplantation. 57 (5), 673-676 (1994).
  5. Roelen, D. L., et al. Relevance of cytotoxic alloreactivity under different immunosuppressive regimens in clinical islet cell transplantation. Clin Exp Immunol. 156 (1), 141-148 (2009).
  6. VanBuskirk, A. M., et al. Human allograft acceptance is associated with immune regulation. J Clin Invest. 106 (1), 145-155 (2000).
  7. Poggio, E. D., Clemente, M., Hricik, D. E., Heeger, P. S. Panel of reactive T cells as a measurement of primed cellular alloimmunity in kidney transplant candidates. J Am Soc Nephrol. 17 (2), 564-572 (2006).
  8. Zitzner, J. R., Tambur, A. R. Role of ELISPOT Assays in Risk Assessment Pre- and Post-Kidney Transplantation. Cells. 1 (2), 100-110 (2012).
  9. Newell, K. A., et al. Identification of a B cell signature associated with renal transplant tolerance in humans. J Clin Invest. 120 (6), 1836-1847 (2010).
  10. Brouard, S., et al. Identification of a peripheral blood transcriptional biomarker panel associated with operational renal allograft tolerance. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (39), 15448-15453 (2007).
  11. Sagoo, P., et al. Development of a cross-platform biomarker signature to detect renal transplant tolerance in humans. J Clin Invest. 120 (6), 1848-1861 (2010).
  12. Halloran, P. F., Famulski, K. S., Reeve, J. Molecular assessment of disease states in kidney transplant biopsy samples. Nat Rev Nephrol. 12 (9), 534-548 (2016).
  13. Li, L., et al. Identification of common blood gene signatures for the diagnosis of renal and cardiac acute allograft rejection. PLoS One. 8 (12), e82153 (2013).
  14. Khatri, P., et al. A common rejection module (CRM) for acute rejection across multiple organs identifies novel therapeutics for organ transplantation. J Exp Med. 210 (11), 2205-2221 (2013).
  15. Halloran, P. F., et al. Microarray diagnosis of antibody-mediated rejection in kidney transplant biopsies: an international prospective study (INTERCOM). Am J Transplant. 13 (11), 2865-2874 (2013).
  16. Mastoridis, S., Issa, F., Wood, K. J. Novel biomarkers and functional assays to monitor cell-therapy-induced tolerance in organ transplantation. Curr Opin Organ Transplant. 20 (1), 64-71 (2015).
  17. Miqueu, P., et al. Analysis of the peripheral T-cell repertoire in kidney transplant patients. Eur J Immunol. 40 (11), 3280-3290 (2010).
  18. Morris, H., et al. Tracking donor-reactive T cells: Evidence for clonal deletion in tolerant kidney transplant patients. Sci Transl Med. 7 (272), 272ra210 (2015).
  19. Dustin, M. L., Bromley, S. K., Kan, Z., Peterson, D. A., Unanue, E. R. Antigen receptor engagement delivers a stop signal to migrating T lymphocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (8), 3909-3913 (1997).
  20. Goldsmith, M. A., Weiss, A. Early signal transduction by the antigen receptor without commitment to T cell activation. Science. 240 (4855), 1029-1031 (1988).
  21. Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285 (5425), 221-227 (1999).
  22. Stoll, S., Delon, J., Brotz, T. M., Germain, R. N. Dynamic imaging of T cell-dendritic cell interactions in lymph nodes. Science. 296 (5574), 1873-1876 (2002).
  23. Juvet, S. C., Sanderson, S., Hester, J., Wood, K. J., Bushell, A. Quantification of CD4(+) T Cell Alloreactivity and Its Control by Regulatory T Cells Using Time-Lapse Microscopy and Immune Synapse Detection. Am J Transplant. 16 (5), 1394-1407 (2016).
  24. Ahmed, F., Friend, S., George, T. C., Barteneva, N., Lieberman, J. Numbers matter: quantitative and dynamic analysis of the formation of an immunological synapse using imaging flow cytometry. J Immunol Methods. 347 (1-2), 79-86 (2009).
  25. Burbach, B. J., et al. Distinct regulation of integrin-dependent T cell conjugate formation and NF-kappa B activation by the adapter protein ADAP. J Immunol. 181 (7), 4840-4851 (2008).
  26. Markey, K. A., et al. Cross-dressing by donor dendritic cells after allogeneic bone marrow transplantation contributes to formation of the immunological synapse and maximizes responses to indirectly presented antigen. J Immunol. 192 (11), 5426-5433 (2014).
  27. Moreau, H. D., et al. Dynamic in situ cytometry uncovers T cell receptor signaling during immunological synapses and kinapses in vivo. Immunity. 37 (2), 351-363 (2012).
  28. Wabnitz, G. H., Nessmann, A., Kirchgessner, H., Samstag, Y. InFlow microscopy of human leukocytes: A tool for quantitative analysis of actin rearrangements in the immune synapse. J Immunol Methods. , (2015).
  29. Ford, W. L., Simmonds, S. J., Atkins, R. C. Early cellular events in a systemic graft-vs.-host reaction. II. Autoradiographic estimates of the frequency of donor lymphocytes which respond to each Ag-B-determined antigenic complex. J Exp Med. 141 (3), 681-696 (1975).
  30. Macedo, C., et al. Contribution of naive and memory T-cell populations to the human alloimmune response. Am J Transplant. 9 (9), 2057-2066 (2009).
  31. Noorchashm, H., et al. A direct method for the calculation of alloreactive CD4+ T cell precursor frequency. Transplantation. 67 (9), 1281-1284 (1999).
  32. Suchin, E. J., et al. Quantifying the frequency of alloreactive T cells in vivo: new answers to an old question. J Immunol. 166 (2), 973-981 (2001).
  33. Lee, R. S., et al. Indirect recognition of allopeptides promotes the development of cardiac allograft vasculopathy. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (6), 3276-3281 (2001).
  34. Pickl, W. F., et al. Molecular and functional characteristics of dendritic cells generated from highly purified CD14+ peripheral blood monocytes. J Immunol. 157 (9), 3850-3859 (1996).
  35. Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J Exp Med. 176 (6), 1693-1702 (1992).
  36. Francis, R. S., et al. Induction of transplantation tolerance converts potential effector T cells into graft-protective regulatory T cells. Eur J Immunol. 41 (3), 726-738 (2011).
  37. Saitovitch, D., Bushell, A., Mabbs, D. W., Morris, P. J., Wood, K. J. Kinetics of induction of transplantation tolerance with a nondepleting anti-Cd4 monoclonal antibody and donor-specific transfusion before transplantation. A critical period of time is required for development of immunological unresponsiveness. Transplantation. 61 (11), 1642-1647 (1996).
  38. Faust, S. M., et al. Role of T cell TGFbeta signaling and IL-17 in allograft acceptance and fibrosis associated with chronic rejection. J Immunol. 183 (11), 7297-7306 (2009).
  39. Yuan, X., et al. A novel role of CD4 Th17 cells in mediating cardiac allograft rejection and vasculopathy. J Exp Med. 205 (13), 3133-3144 (2008).
  40. Emerson, R. O., Mathew, J. M., Konieczna, I. M., Robins, H. S., Leventhal, J. R. Defining the alloreactive T cell repertoire using high-throughput sequencing of mixed lymphocyte reaction culture. PLoS One. 9 (11), e111943 (2014).
  41. Stanford, R. E., Ahmed, S., Hodson, M., Banner, N. R., Rose, M. L. A role for indirect allorecognition in lung transplant recipients with obliterative bronchiolitis. Am J Transplant. 3 (6), 736-742 (2003).
  42. Benichou, G., Valujskikh, A., Heeger, P. S. Contributions of direct and indirect T cell alloreactivity during allograft rejection in mice. J Immunol. 162 (1), 352-358 (1999).
  43. Liu, Z., et al. Contribution of direct and indirect recognition pathways to T cell alloreactivity. J Exp Med. 177 (6), 1643-1650 (1993).

Tags

T Cell AlloreactivityImaging Flow CytometryTransplant ImmunologyDendritic CellsT CellsCell-cell InteractionsFluorescent MicroscopyFlow CytometryCell CultureFixationStainingPerm/wash BufferNuclear DyeBrightfield Imaging

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artículo
Juvet, S. C., Moshkelgosha, S., Sanderson, S., Hester, J., Wood, K. J., Bushell, A. Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (122), e55283, doi:10.3791/55283 (2017).
Descargar cita
Reimpresiones y permisos

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image